虞秀鋒，王啟源，姬文蘭，王亞梅

結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染所引起的人獸共患的慢性呼吸道傳染疾病。只有深入的了解MTB感染與機(jī)體免疫細(xì)胞之間的作用機(jī)制及相關(guān)分子基礎(chǔ)，才能更好地預(yù)防和控制結(jié)核病。MTB作為一種典型的胞內(nèi)寄生菌，機(jī)體被感染后會(huì)啟動(dòng)免疫應(yīng)答，防御MTB的感染，而巨噬細(xì)胞在這個(gè)過程中發(fā)揮重要作用，是宿主抵御MTB感染的第一道防線，被激活后可通過多種機(jī)制有效清除胞內(nèi)的MTB。目前已證實(shí)巨噬細(xì)胞是MTB的關(guān)鍵靶細(xì)胞和宿主細(xì)胞，同時(shí)也是抗MTB的主要效應(yīng)細(xì)胞，在MTB免疫逃逸過程起著極其重要的作用。因此，闡明MTB逃逸機(jī)制，將有助于為結(jié)核病預(yù)防和治療找到新的策略和思路。

在MTB感染過程中，活化的巨噬細(xì)胞可釋放大量的炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS等從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而刺激宿主產(chǎn)生抵抗MTB的免疫反應(yīng)，對MTB的殺滅和清除發(fā)揮十分重要的作用。由于炎癥反應(yīng)對MTB具有特別強(qiáng)的殺傷作用，MTB還能夠釋放多種毒力因子，從而抑制巨噬細(xì)胞的炎癥應(yīng)答反應(yīng)。炎癥應(yīng)答的另一個(gè)分支是誘導(dǎo)一氧化氮合酶(iNOS)的合成，在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的宿主抵抗反應(yīng)中起著十分重要的作用。感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS的活性隨時(shí)間的延長而升高，從而導(dǎo)致NOS的催化底物NO的含量增加。因此，iNOS可催化巨噬細(xì)胞中NO和活性氮介質(zhì)的釋放，可激活巨噬細(xì)胞殺滅胞內(nèi)細(xì)菌[1]。Chart等[2]研究報(bào)道，活化的小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO能夠有效殺死致病的MTB。

MicroRNAs(miRNAs)是一類物種間高度保守的、非編碼、長度為20～24 nt的單鏈小分子RNA，可通過與靶基因mRNA 3′非編碼區(qū)(3′-UTR)互補(bǔ)配對結(jié)合，從而降解靶基因mRNA或者抑制其翻譯，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，參與調(diào)控一系列生物進(jìn)程。大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNAs廣泛參與固有免疫及炎癥應(yīng)答的調(diào)控[3-4]。越來越多研究發(fā)現(xiàn)MTB入侵巨噬細(xì)胞后，miRNAs表達(dá)量發(fā)生改變，可通過靶基因調(diào)控炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響宿主細(xì)胞清除MTB[5-6]。然而，關(guān)于miR-506-3p的作用機(jī)制未見報(bào)道。基于上述研究，本研究建立了穩(wěn)定的BCG感染巨噬細(xì)胞模型，著重探討B(tài)CG感染后巨噬細(xì)胞中miR-506-3p表達(dá)水平的變化情況，闡明在其中發(fā)揮的作用及可能的機(jī)制，從而為深入探討B(tài)CG與宿主細(xì)胞相互作用的分子免疫機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中科院上海細(xì)胞研究所；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone公司，美國)；Trizol試劑及Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司，美國)；RT-PCR試劑盒(Qiagen公司，德國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega公司，美國)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司，美國)；PVDF膜(Millipore公司，美國)；SOCS-3和β-actin抗體(Abcam公司，美國)；ECL發(fā)光試劑(Thermo公司，美國)；TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒(RD公司，美國)；miR-506-3p模擬物(mimics)及陰性對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)條件下。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞密度適度時(shí)進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2制備BCG感染巨噬細(xì)胞模型 將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，細(xì)胞培養(yǎng)液吹打形成細(xì)胞懸液，以2×105cells/孔接種于12孔板中，培養(yǎng)16～24 h。按照感染復(fù)數(shù)為10∶1(細(xì)菌與巨噬細(xì)胞的比例為10∶1)加入細(xì)菌懸液，對照組加入等體積的PBS培養(yǎng)基，放在含CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。感染4 h后，以預(yù)溫的PBS洗滌2次，以清洗掉沒有被巨噬細(xì)胞感染的細(xì)菌。之后加入新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并以此時(shí)作為細(xì)菌感染的零時(shí)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR TRIzol試劑盒抽提上述刺激條件下得到的RAW264.7細(xì)胞的總RNA，應(yīng)用分光光度計(jì)測定純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。應(yīng)用SYBR Green PCR Kit試劑盒測定miR-506-3p的表達(dá)量及細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA表達(dá)水平。采用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)測定各相應(yīng)條帶的灰度值，以U6和β-actin分別作為miR-506-3p和目的基因的內(nèi)參基因。

1.2.4Western Blot檢測蛋白表達(dá) 收集不同處理組的細(xì)胞，經(jīng)RIPA細(xì)胞裂解液獲得各組細(xì)胞的總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取50 μg細(xì)胞總蛋白經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離，之后通過使用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入稀釋的特異性蛋白一抗，置于4 ℃冰箱孵育過夜；次日，用PBST洗滌膜4次；加入HRP標(biāo)記的對應(yīng)的二抗，在室溫條件下孵育1 h，PBST清洗膜3次；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)曝光顯色，并拍照；獲得的蛋白條帶采用凝膠成像分析系統(tǒng)Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，并計(jì)算目的蛋白與β-actin灰度值的比值。

1.2.5ELISA檢測細(xì)胞因子表達(dá) 分別收集不同處理組的細(xì)胞上清液，采用ELISA方法分別檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平，酶標(biāo)儀在450 nm處測得OD值。所有操作步驟嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明規(guī)范進(jìn)行。

1.2.6一氧化氮(Nitric Oxide, NO)釋放量檢測 收集不同處理組的培養(yǎng)上清，操作過程根據(jù)NO檢測試劑盒使用說明進(jìn)行。取200 L培養(yǎng)上清，加入經(jīng)室溫平衡的100 L Griess Reagent R1，再加入等體積Griess Reagent R2，充分混勻后，于室溫條件下放置10 min，酶標(biāo)儀540 nm處測定各樣品的吸光度。

1.2.7CFU計(jì)數(shù)檢測BCG存活率 巨噬細(xì)胞RAW264.7轉(zhuǎn)染miR-506-3p mimics和Negative Control(NC)24 h，被BCG刺激4 h后，用PBS洗滌3次以清除細(xì)胞外細(xì)菌。此后，被感染的細(xì)胞放置培養(yǎng)箱中在指定的時(shí)間內(nèi)孵育。收集細(xì)胞裂解物，并將稀釋后的裂解物接種至含有OADC的Middlebrook 7H10瓊脂平板上培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.8生物信息學(xué)預(yù)測 應(yīng)用TargetScan 5.1，PicTar和miRanda等生物信息學(xué)在線分析軟件進(jìn)行預(yù)測獲得miR-506-3p的靶基因。

1.2.9雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 分別將含有野生型(SOCS-3 3′-UTR-WT)和突變型(SOCS-3 3′-UTR-Mut)的報(bào)告基因載體、pRL-TK質(zhì)粒、miR-506-3p mimics及其陰性對照NC分別共轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，操作步驟嚴(yán)格根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒說明書進(jìn)行，并在酶標(biāo)儀上分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶報(bào)告基因的活性。各組的相對熒光值以螢火蟲熒光強(qiáng)度與海腎熒光強(qiáng)度比值反映。

2 結(jié) 果

2.1MiR-506-3p在BCG感染的巨噬細(xì)胞RAW264.7中低表達(dá) 首先檢測BCG感染的RAW264.7細(xì)胞中miR-506-3p表達(dá)量的變化情況，RT-PCR結(jié)果顯示，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)BCG感染刺激后miR-506-3p的表達(dá)水平在BCG干預(yù)后的12 h，24 h，48 h逐漸下降，并且隨著處理時(shí)間的增加有明顯的降低趨勢(圖1A)，說明BCG感染可引起RAW264.7細(xì)胞中miR-506-3p表達(dá)量下調(diào)。為深入探討miR-506-3p在BCG感染巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答中的具體作用機(jī)制，將其過表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率如圖1B所示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-506-3p mimics后，miR-506-3p的表達(dá)量顯著升高。

A為RT-PCR檢測miR-506-3p的mRNA表達(dá)量，與0 h組相比，#P<0.05;B為RT-PCR用于測定miR-506-3p過表達(dá)轉(zhuǎn)染效率，與NC組相比，*P為<0.05。圖1 BCG感染的RAW264.7細(xì)胞中miR-506-3p表達(dá)量Fig.1 Expression of miR-506-3p in BCG-infected RAW264.7 cell

2.2MiR-506-3p促進(jìn)BCG感染的RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子生成 采用RT-PCR測定TNF-α、IL-1β和IL-6促炎細(xì)胞因子mRNA水平變化量。如圖2A的結(jié)果所示，在BCG感染和未感染的巨噬細(xì)胞RAW264.7中，miR-506-3p過表達(dá)組中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平顯著高于NC組，此結(jié)果表明miR-506-3p能夠增加BCG刺激的巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)量。進(jìn)一步用ELISA方法檢測細(xì)胞因子分泌情況，見圖2B的結(jié)果，在BCG感染和未感染的RAW264.7細(xì)胞中，miR-506-3p過表達(dá)組相較于NC組，炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平明顯升高，與mRNA的表達(dá)趨勢一致。上述結(jié)果提示miR-506-3p可正調(diào)控BCG感染所激發(fā)的炎癥進(jìn)程。

A為RT-PCR用于檢測炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)量;B為ELISA用于檢測炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)量;與NC組相比，*P<0.05。圖2 MiR-506-3p對BCG感染的RAW264.7中炎癥因子表達(dá)的影響Fig.2 Effects of miR-506-3p on the expression of inflammatory mediators in BCG-infected RAW264.7 cells

2.3MiR-506-3p促進(jìn)BCG感染后RAW264.7細(xì)胞中NO釋放和iNOS表達(dá) NO在抗感染等炎癥應(yīng)答中發(fā)揮重要介質(zhì)作用。巨噬細(xì)胞吞噬病原體后隨之活化，并可通過NO相關(guān)途徑殺滅胞內(nèi)細(xì)菌，進(jìn)而觀察miR-506-3p是否能夠影響B(tài)CG激活的巨噬細(xì)胞NO釋放。Griess法結(jié)果如圖3A顯示，相比于NC組，miR-506-3p過表達(dá)后NO分泌量明顯上升，說明miR-506-3p可增加NO的釋放。同時(shí)測定iNOS的mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果如圖3B所示，過表達(dá)miR-506-3p組iNOS表達(dá)量比NC組明顯上升，說明miR-506-3p能夠上調(diào)iNOS的表達(dá)。

A為Griess法用于檢測NO的產(chǎn)生量;B為RT-PCR檢測iNOS的mRNA表達(dá);與NC組相比，*P<0.05。圖3 MiR-506-3p對BCG感染的RAW264.7細(xì)胞中NO的釋放和iNOS表達(dá)的影響Fig.3 Effects of miR-506-3p on NO production and iNOS expression in BCG-infected RAW264.7 cells

2.4MiR-506-3p抑制RAW264.7細(xì)胞中BCG存活率 CFU結(jié)果顯示，miR-506-3p過表達(dá)組與NC組相比，BCG的存活率明顯下降(圖4)，說明miR-506-3p可顯著抑制胞內(nèi)BCG存活率，即有利于BCG的清除。

CFU用于測定胞內(nèi)BCG存活率；與NC組相比，*P<0.05。圖4 MiR-506-3p對巨噬細(xì)胞RAW264.7中BCG存活率的影響Fig.4 Effects of miR-506-3p on BCG survival in RAW264.7 cells

2.5MiR-506-3p靶向調(diào)控SOCS-3的表達(dá) 利用TargetScan 5.1、PicTar和miRanda等生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測miR-506-3p靶基因，初步預(yù)測所得miR-506-3p可靶向結(jié)合SOCS-3的3′-UTR區(qū)(圖5A)。進(jìn)一步采用雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-506-3p可顯著抑制SOCS-3 3′-UTR-WT的熒光素酶活性，而對SOCS-3 3′-UTR-Mut熒光素酶活性無明顯變化(圖5B)。進(jìn)而采用RT-PCR及Western Blot方法證實(shí)miR-506-3p對SOCS-3表達(dá)的影響，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-506-3p后可顯著降低SOCS-3的mRNA(圖5C)和蛋白水平(圖5D)。綜上，miR-506-3p能夠靶向結(jié)合SOCS-3的3′-UTR區(qū)并負(fù)調(diào)控其表達(dá)。

(A)生物信息學(xué)預(yù)測miR-506-3p靶向結(jié)合SOCS-3的3′-UTR區(qū);(B)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)評估熒光素酶活性;(C)RT-PCR用于檢測SOCS-3的mRNA表達(dá)量;(D)Western Blot用于檢測SOCS-3蛋白表達(dá)水平。與NC組相比，*P<0.05；與Control組相比，#P<0.05。圖5 SOCS-3是miR-506-3p的直接靶基因Fig.5 SOCS-3 is a direct target gene of miR-506-3p

3 討 論

MTB感染后，巨噬細(xì)胞會(huì)通過許多信號通路激活自身，導(dǎo)致釋放大量炎癥細(xì)胞因子，從而提高機(jī)體的免疫殺傷功能，促使巨噬細(xì)胞清除病原菌。TNF-α作為一種重要的信號分子，是觸發(fā)炎癥應(yīng)答反應(yīng)的主要炎癥因子。IL-1β和IL-6是引起機(jī)體炎癥反應(yīng)關(guān)鍵的細(xì)胞因子，可在MTB感染后誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答，在宿主免疫中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道BCG感染能夠誘導(dǎo)炎癥因子IL-1β和IL-6的表達(dá)[7]。本研究結(jié)果揭示，miR-506-3p過表達(dá)后可促進(jìn)BCG刺激RAW264.7細(xì)胞中的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，從而參與炎癥反應(yīng)調(diào)控進(jìn)程。

巨噬細(xì)胞吞噬MTB后，通過形成吞噬小體，刺激細(xì)胞呼吸，從而生產(chǎn)大量活性氮中間體，而這些物質(zhì)具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，增強(qiáng)對細(xì)菌的殺傷力。而活性氮的生成依賴于iNOS。NO是巨噬細(xì)胞通過氧依賴途徑分泌生成的能直接殺滅MTB的重要分子[8]。RAW264.7細(xì)胞感染BCG后，miR-146a的表達(dá)量升高，通過靶向作用于TRAF6抑制NF-κB和MAPK通路的激活，從而導(dǎo)致iNOS的表達(dá)和NO的產(chǎn)生降低，促進(jìn)巨噬細(xì)胞中MTB的存活[9]。巨噬細(xì)胞經(jīng)MTB早期分泌蛋白ESAT-6處理后，let-7f的表達(dá)量下降，let-7f通過靶向作用于A20調(diào)控胞內(nèi)活性氧與活性氮的表達(dá)量，以避免毒性反應(yīng)的發(fā)生，從而使得胞內(nèi)MTB存活率升高[5]。miR-155通過靶向調(diào)節(jié)C/EBPβ的表達(dá)，從而改變NOS2表達(dá)及NO的產(chǎn)生，進(jìn)而影響胞內(nèi)MTB的生存能力[10]。因此，通過檢測過表達(dá)miR-506-3p后NO的釋放情況，以判斷巨噬細(xì)胞的殺菌功能。結(jié)果揭示，miR-506-3p可顯著增加BCG感染的巨噬細(xì)胞中NO的釋放，同時(shí)iNOS的表達(dá)水平上調(diào)?；罨木奘杉?xì)胞通過殺滅胞內(nèi)細(xì)菌也是巨噬細(xì)胞抗MTB感染的重要途徑之一。繼而檢測了巨噬細(xì)胞內(nèi)BCG的存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-506-3p過表達(dá)后胞內(nèi)BCG的存活率降低。以上結(jié)果揭示miR-506-3p通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞的炎癥進(jìn)程從而抑制巨噬細(xì)胞的殺傷，為找尋治療結(jié)核分枝桿菌的潛在靶點(diǎn)提供了新的理論基礎(chǔ)。

SOCS(Suppressor of cytokine signaling)家族是細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。SOCS-3通過調(diào)節(jié)許多免疫分子的信號，從而參與各種炎癥及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)SOCS-3在肺結(jié)核患者中高表達(dá)[11]；另有研究表明BCG感染能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中SOCS-3高表達(dá)[12]。與前期研究結(jié)果一致，SOCS-3在BCG感染的RAW264.7細(xì)胞中明顯上調(diào)，且BCG刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的SOCS-3和SOCS-1可抑制IFN-刺激的JAK/STAT信號通路[12]。SOCS-3高表達(dá)肺結(jié)核患者中Th1型細(xì)胞因子表達(dá)降低[13]。上述結(jié)果均已證實(shí)miR-506-3p在BCG感染激活的免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，顯著促進(jìn)BCG刺激引起的炎癥應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的殺菌功能，進(jìn)而促進(jìn)了BCG在巨噬細(xì)胞內(nèi)的免疫清除。我們又繼續(xù)闡明miR-506-3p引起炎癥因子表達(dá)升高的具體調(diào)控機(jī)制。通過PicTar和TargetScan 5.1等miRNA靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)SOCS-3可能是miR-506-3p的潛在靶點(diǎn)。利用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)而證實(shí)miR-506-3p能夠直接靶向調(diào)控SOCS-3的表達(dá)。RT-PCR和Western Blot進(jìn)一步證實(shí)miR-506-3p負(fù)向調(diào)控靶基因SOCS-3的表達(dá)。由此表明miR-506-3p通過下調(diào)靶基因SOCS-3顯著增加BCG活化的巨噬細(xì)胞釋放促炎因子的能力及NO的分泌，揭示miR-506-3p對BCG感染導(dǎo)致炎癥的負(fù)性調(diào)控作用是通過抑制SOCS-3的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上，miR-506-3p在BCG感染刺激巨噬細(xì)胞的炎癥應(yīng)答過程中發(fā)揮非常重要的調(diào)控作用，可促進(jìn)促炎因子的釋放及NO的產(chǎn)生，從而加劇巨噬細(xì)胞的殺傷作用，進(jìn)而抑制BCG在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活和繁殖，其可能作用的分子機(jī)制是通過負(fù)調(diào)控靶基因SOCS-3表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。MiR-506-3p在BCG感染的巨噬細(xì)胞中發(fā)揮的重要作用及其相關(guān)機(jī)制，為研發(fā)新型結(jié)核疫苗及篩選抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)提供一定的理論依據(jù)。

利益沖突：無