顏淵鴛，李 丹，趙燕姣，陶曉靜，沈 鳳，楊 鵬，羅雪蘭，歐和生

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病的主要病因，也是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一［1］。氧化應(yīng)激下，過量活性氧（reactive oxygen species，ROS）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在AS的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［2］。

微RNA（microRNA，miRNA，miR）是長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，通過與靶基因的3非翻譯區(qū)（3 untranslated region，3ntraR）結(jié)合，導(dǎo)致其mRNA降解或抑制蛋白翻譯，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［3］。miRNA廣泛參與體內(nèi)各種細(xì)胞和組織的生理病理過程，與細(xì)胞增殖、凋亡和分化以及組織器官的發(fā)育等調(diào)控過程密切相關(guān)［4］。研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)異常的miRNA在血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells，VEC）凋亡的調(diào)控中起著重要的作用［5］。miR-24是內(nèi)皮細(xì)胞存活和血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［6］，參與VEC增殖、凋亡和血管形成等功能的調(diào)節(jié)。有研究表明［7］，miR-24在心肌內(nèi)皮細(xì)胞中富集，并在心肌缺血損傷后表達(dá)上調(diào)。下調(diào)miR-24可抑制VEC凋亡，增加心肌梗死后的毛細(xì)血管密度及縮小梗死面積，從而保護(hù)心臟功能。然而，關(guān)于miR-24是否參與氧化應(yīng)激下VEC功能的調(diào)控仍待探討。為進(jìn)一步研究miR-24在VEC氧化損傷中的作用，本研究在人臍靜脈VEC（human umbilical VEC，HUVEC）氧化損傷模型下，觀測(cè)細(xì)胞存活、遷移和凋亡，檢測(cè)Bax、Bcl-2和胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），胎牛血清（Lonsera，烏拉圭），慢病毒GV367載體，AgeI/NheI酶切（上海吉?jiǎng)P基因），過氧化氫（Sigma，美國(guó)）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（北京索萊寶），細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)），Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海聯(lián)科生物），RNA提取試劑盒（Axygen，美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量PCR試劑盒（TAKERA，日本），兔抗人GAPDH多抗（武漢三鷹），兔抗人Bax單抗、兔抗人Bcl-2單抗和兔抗人胱天蛋白酶3單抗和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（Cell Signaling Technology，美國(guó)）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)），Bio-Rad電泳儀（Bio-Rad，美國(guó)），BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)），OLYMPUS CK2光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯株式會(huì)社，日本）。

1.2 miR-24表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

miR-24序列（miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)）為5`UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′，anti-miR-24用于下調(diào)miR-24并干擾其作用，序列與miR-24互補(bǔ)，5′-ACCGAGUCAAGUCGUCCUUGUC-3′，miR-24 NC為隨機(jī)序列，5′-GUCAUCAGUCGAGCUAGACGAG-3′。予上海吉?jiǎng)P基因有限公司應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）調(diào)取目的基因及雙鏈DNA核苷酸片段，通過基因重組技術(shù)將目的基因片段克隆到GV367慢病毒載體中，構(gòu)建miR-24高表達(dá)、antimiR-24及陰性對(duì)照慢病毒質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA測(cè)序和qRT-PCR檢測(cè)miR-24表達(dá)水平（引物序列見表1）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HUVEC（武漢Procell）用含15%胎牛血清、1%鏈霉素+青霉素（青霉素濃度為100 kU·L-1，鏈霉素濃度為0.1 g·L-1）DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。選擇傳代數(shù)低且生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)良好的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染，HUVEC接種于6孔板中，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，選擇最適的病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=70，配制轉(zhuǎn)染液：每孔加入轉(zhuǎn)染增強(qiáng)液1 mL+聚凝胺5 ng·L-1+病毒體積，根據(jù)公式計(jì)算病毒體積：病毒體積=MOI/病毒滴度。棄原培養(yǎng)液，每孔加入1 mL轉(zhuǎn)染液，待8～12 h后更換新鮮的15%胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后，用終濃度為5 ng·L-1嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基殺滅未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，72 h后換液棄去死細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，并用qRT-PCR檢驗(yàn)miR-24表達(dá)水平。

Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.4 細(xì)胞分組和建立細(xì)胞氧化損傷模型

成功轉(zhuǎn)染miR-24高表達(dá)、anti-miR-24及miR-24-NC后，細(xì)胞分5組：正常對(duì)照組（未處理細(xì)胞）、H2O2組（H2O2500 μmol·L-1處理12 h）、H2O2+miR-24組（轉(zhuǎn)染miR-24高表達(dá)慢病毒質(zhì)粒后，再用H2O2500 μmol·L-1處理 12 h）、H2O2+anti-miR-24 組和H2O2+miR-24 NC組（轉(zhuǎn)染相應(yīng)慢病毒質(zhì)粒后，H2O2處理相同）。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

細(xì)胞以每孔5×103接種于96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，按1.4分組處理細(xì)胞，去培養(yǎng)基，每孔加入稀釋好的MTT溶液（0.5 g·L-1）（DMEM∶MTT=10∶1）100 μL，避光孵育4 h。去上清，每孔加DMSO 100 μL，混勻振蕩10 min后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度值（A490nm），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A490nm-空白組A490nm）/（細(xì)胞對(duì)照組A490nm-空白組A490nm）×100%。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率

細(xì)胞以每孔8×104接種于24孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)，按1.4分組處理細(xì)胞。H2O2處理后用200 μL槍頭垂直均勻劃出一條筆直的橫線，PBS洗3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別于0和24 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，拍照并測(cè)量劃痕寬度，遷移率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.7 Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡

細(xì)胞以每孔2×105接種于6孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，按1.4分組處理細(xì)胞。吸盡培養(yǎng)液，加入0.5mL固定液，固定10min。去固定液用PBS洗2次，每次3 min。加入0.5 mL Hoechst33258染色液，染色5 min。去染色液，PBS洗2次，每次3 min，吸盡液體，在激發(fā)波長(zhǎng)350 nm、發(fā)射波長(zhǎng)460 nm熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)各組凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞比值，每組統(tǒng)計(jì)3個(gè)視野，取平均值。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞以每孔8×105接種于6孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，按1.4分組處理細(xì)胞。收集細(xì)胞（包括培養(yǎng)液），500 μL 1×結(jié)合緩沖液（binding buffer）重懸細(xì)胞。每管加入5 μL Annexin Ⅴ-APC和10 μL 7-AAD，輕柔混勻后，室溫避光孵育5 min，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.9 qRT-PCR檢測(cè)miR-24，Bax，Bcl-2和胱天蛋白酶3 mRNA表達(dá)

各組細(xì)胞以每孔8×105接種于6孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，按1.4分組處理細(xì)胞。按說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。引物序列見表1，miR-24反應(yīng)條件：以U6為內(nèi)參，95℃1 min，95℃15 s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)。目的基因反應(yīng)條件：以 GAPDH 為內(nèi)參，95℃，2 min；95℃，15 s；60℃，15 s；72℃，1 min，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.10 Western印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Bax、Bcl2和胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)

1.10.1 Western印跡法

收集1.4分組處理的細(xì)胞，加適量裂解液，冰上裂解15 min，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取40 g·L-1蛋白，12%SDS-PAGE上樣、電泳分離后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%BSA室溫封閉1 h，加入Bax、Bcl-2和胱天蛋白酶3（1∶1000）、GAPDH（1∶10000）一抗，4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗3次，各10 min。加入二抗（1∶5000），室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗3次，各10 min。用雙色熒光掃描成像系統(tǒng)采集蛋白電泳條帶的吸光度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算蛋白積分以目標(biāo)蛋白積分吸光度值（integrative absorbance，IA）與GAPDH IA比值表示蛋白相對(duì)量。重復(fù)3次，取平均值。

1.10.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法

細(xì)胞以每孔8×105接種于6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，每組3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，按1.4分組處理細(xì)胞。PBS洗2次，4%多聚甲醛固定10 min。PBS洗2次，0.5%Triton X-100（DPBS配）孵育20 min。PBS洗2次，3%H2O2孵育10 min。PBS洗2次，血清封閉孵育20 min，一抗孵育（PBS配，1∶500稀釋，濕盒）4℃過夜。次日PBS洗2次，二抗工作液孵育（濕盒）37℃30 min。PBS清洗后DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色）約10 min。PBS洗2次，蘇木素復(fù)染10 min。PBS洗5 min，樹膠封片，鏡下觀察蛋白表達(dá)情況，圖像采用Image Pro Plus（IPP）軟件計(jì)算IA，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HUVEC慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染miR-24表達(dá)水平

qRT-PCR結(jié)果顯示（表2），與miR-24 NC組比較，miR-24高表達(dá)組miR-24表達(dá)水平增加（P＜0.05），anti-miR-24組表達(dá)水平降低（P＜0.05），說(shuō)明慢病毒質(zhì)粒HUVEC穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功。

Tab.2 Expression of miR-24 in human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）

2.2 轉(zhuǎn)染miR-24對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷HUVEC存活的影響

MTT結(jié)果所示（表3），與正常對(duì)照組比，H2O2組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05），H2O2+miR-24 NC組與H2O2組細(xì)胞存活率比較無(wú)顯著差異；與H2O2+miR-24 NC組比，H2O2+miR-24高表達(dá)組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）；H2O2+anti-miR-24組細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）。提示miR-24對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷HUVEC存活具有抑制作用。

Tab.3 Effect of miR-24 transfection on viability of H2O2-injured HUVECs

2.3 轉(zhuǎn)染miR-24對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷HUVEC遷移的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)顯示（圖1），與正常對(duì)照組比，H2O2組和各轉(zhuǎn)染組遷移率下降（P＜0.05），H2O2+miR-24 NC組與H2O2組遷移率比較無(wú)顯著差異；與H2O2+miR-24 NC組比，H2O2+miR-24高表達(dá)組遷移率降低（P＜0.05），H2O2+anti-miR-24組增加（P＜0.05）。提示miR-24對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷HUVEC遷移具有一定的抑制作用。

Fig.1 Effect of miR-24 transfection on migration of H2O2-injured HUVECs.See Tab.3 for the cell treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with H2O2+miR-24 NC group.

2.4 轉(zhuǎn)染miR-24對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷HUVEC凋亡的影響

2.4.1 Hoechst33258染色

Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示（圖2），與正常對(duì)照組相比，H2O2組部分胞核呈致密高亮熒光（如圖2A箭頭所示），凋亡率升高（P＜0.05）。H2O2+miR-24 NC組與H2O2組細(xì)胞凋亡率比較無(wú)顯著差異；與H2O2+miR-24 NC組相比，H2O2+miR-24高表達(dá)組凋亡率增加（P＜0.05），H2O2+anti-miR-24組凋亡率降低（P＜0.05）。提示轉(zhuǎn)染miR-24對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC凋亡具有促進(jìn)作用。

Fig.2 Effect of miR-24 transfection on apoptosis in H2O2-injured HUVECs by Hoechst33258.See Tab.3 for the cell treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with H2O2+miR-24 NC group.

2.4.2 流式細(xì)胞術(shù)

流式檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3），與正常對(duì)照組比，H2O2組、H2O2+miR-24高表達(dá)組、H2O2+anti-miR-24及H2O2+miR-24 NC組細(xì)胞凋亡率均顯著增加（P＜0.05），H2O2+miR-24 NC組與H2O2組細(xì)胞凋亡率比較無(wú)顯著性差異；與H2O2+miR-24 NC組比，H2O2+miR-24高表達(dá)組凋亡率增加（P＜0.05），H2O2+antimiR-24組降低（P＜0.05）。與Hoechst33258熒光染色法結(jié)果趨勢(shì)一致，流式檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)染miR-24對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVEC凋亡具有促進(jìn)作用。

2.5 轉(zhuǎn)染miR-24對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷HUVEC中Bax、Bcl-2和胱天蛋白酶3 mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示（表4），與正常對(duì)照組比，H2O2組Bax和胱天蛋白酶3 mRNA表達(dá)增加，Bcl-2mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），H2O2+miR-24 NC與H2O2組蛋白mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異；與H2O2+miR-24 NC組比，H2O2+miR-24高表達(dá)組Bax和胱天蛋白酶3 mRNA表達(dá)增加，Bcl-2mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），而H2O2+anti-miR-24組結(jié)果與此相反（P＜0.05）。提示HUVEC氧化損傷模型中，轉(zhuǎn)染miR-24可在轉(zhuǎn)錄水平增加Bax和胱天蛋白酶3 mRNA表達(dá)、降低Bcl-2mRNA表達(dá)。

2.6 轉(zhuǎn)染miR-24對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷HUVEC中Bax，Bcl-2和胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)的影響

2.6.1 Western印跡法

結(jié)果顯示（圖4），與正常對(duì)照組比，H2O2組Bax和胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），H2O2+miR-24 NC與H2O2組蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異；與H2O2+miR-24 NC組比，H2O2+miR-24高表達(dá)組Bax和胱天蛋白酶3的蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），而H2O2+anti-miR-24組結(jié)果與此相反（P＜0.05）。提示上調(diào)miR-24可增加氧化損傷HUVEC中Bax和胱天蛋白酶3表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平。

2.6.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法

結(jié)果顯示（圖5），細(xì)胞核內(nèi)或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，Bax、Bcl-2和胱天蛋白酶3蛋白均在胞漿表達(dá)。與正常對(duì)照組比，H2O2組Bax、胱天蛋白酶3陽(yáng)性細(xì)胞增加，蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），H2O2+miR-24 NC與H2O2組蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異；與H2O2+miR-24 NC組比，H2O2+miR-24高表達(dá)組Bax和胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），而H2O2+antimiR-24組結(jié)果與此相反（P＜0.05）。提示上調(diào)miR-24可增加氧化損傷HUVEC中Bax和胱天蛋白酶3表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平。

Fig.3 Effect of miR-24 transfection on apoptosis in H2O2-injured HUVECs by flow cytometry.See Tab.3 for the cell treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with H2O2+miR-24 NC group.

Tab.4 Effect of miR-24 transfection on mRNA levels of Bax，Bcl-2 and caspase 3 in H2O2-injured HUVECs

Fig.4 Effect of miR-24 transfection on protein expressions of Bax(B)，Bcl-2(C)and caspase 3(D)in H2O2-injured HUVECs by Western blotting.See Tab.3 for the cell treatment.B，C and D were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with H2O2+miR-24 NC group.

Fig.5 Effect of miR-24 transfection on protein expressions of Bax(B)，Bcl-2(C)and caspase 3(D)in H2O2-injured HUVECs by immunocytochemistry.See Tab.3 for the cell treatment.B，C and D were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with H2O2+miR-24 NC group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在HUVEC氧化損傷模型中，上調(diào)miR-24可增加HUVEC凋亡，降低細(xì)胞存活和遷移能力，其機(jī)制可能與其促進(jìn)Bax、胱天蛋白酶3和抑制Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

VEC凋亡是一種基因編碼的程序性死亡，可以從體內(nèi)清除多余和有害的細(xì)胞，維持細(xì)胞的正常分化與發(fā)育［8］。異常的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可破壞內(nèi)皮細(xì)胞的完整性和屏障功能，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞失去調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、免疫和炎癥的功能［9］。其中氧化損傷誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，是多種心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一［10-11］。miRNA作為基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)，參與調(diào)節(jié)VEC凋亡［12-13］。例如，miR-150在氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）誘導(dǎo)HUVEC凋亡過程中表達(dá)上調(diào)，抑制miR-150表達(dá)可減少VEC凋亡［14］。miR-210通過下調(diào)CASP8AP2通路和減少ROS產(chǎn)生，保護(hù)VEC免受氧化損傷［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-24促進(jìn)氧化損傷下HUVEC凋亡，抑制miR-24表達(dá)可減少HUVEC氧化損傷。

miR-24是一種在內(nèi)皮細(xì)胞和高血管組織中富集的miRNA［16］，對(duì)VEC功能具有特異性調(diào)控作用，其表達(dá)異常與許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-24在氧化應(yīng)激下VEC中高表達(dá)，并通過調(diào)控生長(zhǎng)因子TGF-β參與心肌纖維化的過程［17］。此外，miR-24還能降低缺血低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌梗死所致的心臟重構(gòu)。近年來(lái)，miR-24在癌癥和心肌梗死中的調(diào)控作用已被廣泛研究，但其對(duì)VEC凋亡的研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，氧化損傷下miR-24高表達(dá)組細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞存活和遷移率下降，抑制miR-24表達(dá)可明顯降低細(xì)胞凋亡率，并進(jìn)一步增加細(xì)胞細(xì)胞存活和遷移能力。表明，miR-24可促進(jìn)氧化損傷下HUVEC凋亡，并抑制其存活和遷移能力。

細(xì)胞凋亡從分子機(jī)制上闡述為DNA片段斷裂或蛋白質(zhì)水解［18］，Bcl-2蛋白家族是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［19-20］?？沟蛲龅鞍祝˙cl-xl，Bcl-w，Bcl-2和Mcl-1等）和促凋亡蛋白（Bax、Bak等）共同調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性，控制釋放細(xì)胞色素c以及其他凋亡因子進(jìn)入胞漿，激活胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)的下游信號(hào)，剪切RNA及DNA修復(fù)相關(guān)蛋白［21］。Bcl-2蛋白家族對(duì)組織穩(wěn)態(tài)、胚胎發(fā)育和血細(xì)胞成熟具有重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用。研究表明，Bcl-2蛋白家族調(diào)控VEC凋亡與多種心血管疾病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。例如，miR-126通過降低胱天蛋白酶3活性和增加Bcl-2蛋白表達(dá)水平，抑制VEC凋亡，降低AS動(dòng)脈壁通透性，進(jìn)而延緩AS發(fā)展［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)HUVEC凋亡后，miR-24高表達(dá)組Bax和胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而anti-miR-24組結(jié)果與此相反。同樣，qRTPCR在基因轉(zhuǎn)錄水平也證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)。提示，miR-24可能通過促進(jìn)Bax和胱天蛋白酶3和抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)HUVEC凋亡，并進(jìn)一步抑制HUVEC的存活和遷移能力。

綜上所述，本研究表明，在HUVEC氧化損傷模型中，miR-24通過促進(jìn)Bax、胱天蛋白酶3和抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，增加HUVEC凋亡，降低細(xì)胞存活和遷移能力。而下調(diào)miR-24可減少細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞存活及遷移能力。然而關(guān)于miR-24對(duì)HUVEC凋亡的調(diào)控作用并不只受單一的分子機(jī)制調(diào)節(jié)，還有其他凋亡相關(guān)途徑是已知的，研究miR-24與這些途徑的關(guān)系及確定其在體內(nèi)模型中的潛在機(jī)制還需進(jìn)一步探討。