馮小娟，邵云云，劉俊瑾，郭一婷，侯銳鋼

（山西醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院，2.第二醫(yī)院，山西 太原 030000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以黏膜炎和潰瘍形成為主要表現(xiàn)的非特異性慢性炎癥性腸疾病，可發(fā)生于結(jié)直腸的任意部位，患者常出現(xiàn)腹瀉腹痛，體質(zhì)量減輕和膿血便等癥狀［1-2］。該病常年遷延不愈且易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者及其家人的生活質(zhì)量，目前，認(rèn)為炎癥反應(yīng)及免疫失衡對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展有重要作用［3-4］。美沙拉嗪（mesalazine，Mes）作為臨床上治療UC的常用藥物，具有良好的抗炎作用，療效確切，效果顯著，但其具體分子作用機(jī)制尚不清楚。新近研究發(fā)現(xiàn)，孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）作為一種重要的配體依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在大鼠結(jié)腸組織中大量分布，且與炎癥性腸疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5-6］，如SHAH等［7］研究表明，PXR激活可抑制炎癥而改善硫酸葡聚糖鈉誘導(dǎo)的炎癥腸疾病等；MENCARELLI等［8］研究表明，PXR依賴性途徑可抑制NF-κB通路從而調(diào)節(jié)利福昔明對(duì)腸上皮細(xì)胞先天免疫反應(yīng)。Mes是否可通過(guò)調(diào)節(jié)PXR/NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制炎癥從而治療潰瘍性結(jié)腸炎尚不明確。

本研究采用Mes干預(yù)UC模型大鼠，通過(guò)觀察PXR/NF-κB信號(hào)通路及炎癥因子的變化，探討其在Mes干預(yù)UC中的作用，進(jìn)一步為Mes的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

Mes緩釋顆粒（國(guó)藥批準(zhǔn)字H20143164，上海愛(ài)的發(fā)制藥有限公司）；注射用利福平（rifampicin，Rif，批號(hào)：20170941，重慶華邦制藥有限公司）；酮康唑（ketoconazole，Ket，批號(hào)：20180422，武漢東康源科技有限公司）；2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid solution，TNBS，美國(guó)Sigma公司）；髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）測(cè)試盒（南京建成有限公司）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）和IL-13 ELISA試劑盒（上海優(yōu)選有限公司）；Pxr，NF-κB，NF-κB p65，κB抑制因子α（inhibitor of κB alpha，IκB-α）引物（生工生物工程股份有限公司）；一抗：小鼠抗大鼠β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（美國(guó)ABcam公司），兔抗大鼠PXR多克隆抗體和兔抗大鼠磷酸化NF-κB p65（p-P65）多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔lgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）

SQP型電子分析天平購(gòu)買自德國(guó)Sartorius公司，Spectra MAX 190酶標(biāo)儀購(gòu)買自美國(guó)Molecular Device公司，Vortex-5型渦旋儀購(gòu)買自中國(guó)Kylin-bell公司，SB3200型超聲儀購(gòu)買自上海Brandson公司，DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)購(gòu)買自寧波新芝生物科技，Biofuge primo R型離心機(jī)和DYY-7C型電泳儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，WD-9405F型脫色搖床和HH.S21-6型水浴鍋購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；StepOne Plus型RT-PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems。

1.2 動(dòng)物、模型制備和評(píng)價(jià)［9］

40只6～8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，合格證號(hào)SCXK（京）2014-0013（中國(guó)食品藥品檢定研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院動(dòng)物中心進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，期間可自由攝食和飲水。

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，造模。大鼠乙醚吸入麻醉，特制的硅膠導(dǎo)管插入離大鼠肛門8 cm處，結(jié)腸緩慢灌注含50%乙醇的TNBS（3.6 g·L-1）溶液，每只0.8 mL，正常組結(jié)腸灌注等量生理鹽水。給藥結(jié)束后，為防止藥液遺漏，倒置1 min，后將大鼠倒置放于泡沫板（45°斜面）上直至蘇醒。造模完成后，連續(xù)4 d每日監(jiān)測(cè)大鼠體質(zhì)量變化并記錄糞便性狀和便血情況，計(jì)算病變活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）［10］。具體計(jì)算方法如下：體質(zhì)量下降率（＜1%計(jì)0分；1%～5%計(jì)1分；5%～10%計(jì)2分；10%～15%計(jì)3分；＞15%計(jì)4分）、糞便性狀（正常0分；成形軟便2分；不成形軟便3分；腹瀉4分）和潛血狀態(tài)（無(wú)出血0分；輕微出血2分；嚴(yán)重出血4分）。DAI=（體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+便潛血分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)）/3，模型組病變活動(dòng)指數(shù)若為正常組的2倍以上，則視為造模成功。

1.3 給藥和樣品采集

大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，即正常對(duì)照組、UC模型組、Mes 300 mg·kg-1組、PXR激動(dòng)劑Rif 50 mg·kg-1+Mes組和PXR抑制劑Ket 35 mg·kg-1+Mes組。取1.2制備成功的模型大鼠，ig給予Mes混懸液（劑量根據(jù)動(dòng)物與人體每公斤體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表?yè)Q算得到），連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)期間，所有大鼠可自由獲取水和食物。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，7%水合氯醛深度麻醉，腹主動(dòng)脈取血；解剖大鼠，肉眼觀察大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織黏膜的變化，于-80℃保存。

1.4 HE染色觀察近端結(jié)腸病理變化

近端結(jié)腸用4%甲醛固定，HE染色觀察大鼠結(jié)腸病變情況，根據(jù)肉眼評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（水腫、縮短變窄、潰瘍形成、充血）和組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（病變范圍、黏膜損失和腺體排列）［11-12］，評(píng)估各組大鼠的差異。

1.5 ELlSA檢測(cè)血漿中TNF- α，lFN- γ，lL-4和lL-13含量

肝素抗凝的大鼠血液，4000×g離心30 min取上清，制備血漿。使用試劑盒測(cè)定血漿中TNF-α，IFN-γ，IL-4和IL-13的含量。操作步驟按樣品說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 比色法檢測(cè)結(jié)腸組織髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性

稱取約0.04 g結(jié)腸組織樣本，按質(zhì)量體積比為1∶19加勻漿介質(zhì)制備成5%組織勻漿，不需進(jìn)行離心。取5%組織勻漿0.9 mL加試劑盒中的3號(hào)試劑0.1 mL，充分混勻后37℃水浴15 min，取出后待測(cè)。按說(shuō)明書配制對(duì)照管和測(cè)定管，混勻，60℃水浴10 min，取出后立即使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（460 nm）測(cè)各管吸光度值。按公式測(cè)定MPO活性，單位為U·g-1組織。

1.7 實(shí)時(shí) PCR測(cè)定結(jié)腸組織中Pxr，NF- κB，NF- κB p65和I κB- α mRNA表達(dá)水平

稱取結(jié)腸組織樣本約0.015 g，用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒快速提取總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)其純度和濃度，若A260nm/A280nm在1.8～2.1之間則以RNA為模板合成第一鏈cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用 20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性15 min，95℃ 變性 15 s，60℃ 退火 31 s，72℃ 延伸30 s，共50個(gè)循環(huán)；β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參基因。引物序列見(jiàn)表1。以2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 Western印跡法檢測(cè)結(jié)腸組織PXR和p-P65蛋白表達(dá)水平

稱取各組大鼠結(jié)腸組織0.04 g，加0.4 mL RIPA與PMSF的混合裂解液提取總蛋白，用BCA法確定濃度。配制分離膠和濃縮膠后，上樣，電泳（200 V，1 h），轉(zhuǎn)膜（50 V，3 h 10 min），TBST洗3次，5%牛奶室溫封閉30 min，將PVDF膜置于一抗（1∶1500）孵育盒，4℃過(guò)夜，TBST洗3次，再與二抗（1∶1500）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液孵育后曝光成像。用Image J軟件定量分析條帶積分吸光度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

Tab.1 Primers used in real-time PCR

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 美沙拉嗪對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠體質(zhì)量的影響

模型組大鼠行動(dòng)遲緩，食欲缺乏，體質(zhì)量明顯下降并伴有稀便、血便的癥狀，DAI指數(shù)均為正常對(duì)照組的2倍以上。與模型組相比，給藥組大鼠體質(zhì)量回升明顯，大便恢復(fù)正常；模型+Mes+Rif組體質(zhì)量也回升，大便恢復(fù)正常；模型+Mes+Ket組大鼠行動(dòng)正常，體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，部分大鼠有稀便癥狀。與模型+Mes組相比，造模后模型+Mes+Rif組體質(zhì)量回升明顯（P＜0.05）；而模型+Mes+Rif組大鼠體質(zhì)量整體呈下降趨勢(shì)（圖1）。

2.2 美沙拉嗪對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織的影響

Fig.1 Effect of mesalazine（Mes）on body mass of ulcerative colitis rats.A model of male Sprague-Dawley rats were established by rectal administration of 2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid（TNBS）0.8 mL per rat.The body mass and fecal traits of each group were observed every day for 4 d，and the disease activity index（DAI）was calculated.Model rats were given ig Mes 300 mg·kg-1·d-1（Mes group），rifampicin 50 mg·kg-1·d-1+Mes group（Rif+Mes group）and ketoconazole 35 mg·kg-1·d-1+Mes group（Ket+Mes group）was given Rif and Ket first，and Mes were given 4 d later for 7 d.±s，n=8.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group；△P＜0.05，compared with model+Mes group.

肉眼觀察正常對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)正常，鏡下腸道結(jié)構(gòu)清晰，未發(fā)生黏連，無(wú)明顯充血、糜爛和潰瘍形成。模型組大鼠腸道發(fā)生嚴(yán)重黏連，腸壁變厚，黏膜及下層可見(jiàn)多個(gè)大小不一的潰瘍和多處炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，局部發(fā)生水腫糜爛，肉眼評(píng)分和病理評(píng)分明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；模型+Mes組病變程度減輕，僅部分可見(jiàn)充血和糜爛，潰瘍基本愈合，僅可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肉眼評(píng)分和病理評(píng)分低于模型組（P＜0.05）；模型+Mes+Rif組潰瘍面積減少，仍有部分炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（P＜0.05）；模型+Mes+Ket組仍有潰瘍，也有部分炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）。

2.3 美沙拉嗪對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血漿中TNF- α，lFN- γ，lL-4和lL-13含量及結(jié)腸組織中MPO活性的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血漿中IFN-γ和TNF-α含量及結(jié)腸中MPO活性明顯升高（P＜0.01，P＜0.05），IL-4和IL-13的含量明顯下降（P＜0.05）；與模型組相比，模型+Mes組和模型+Mes+Rif組大鼠血漿中IFN-γ和TNF-α含量及結(jié)腸中MPO活性均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），IL-4與IL-13的含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；模型+Mes+Ket組炎癥因子的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型+Mes組相比，模型+Mes+Rif組和模型+Mes+Ket組大鼠血漿炎癥因子的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.4 美沙拉嗪對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織中Pxr，NF- κB，NF- κB p65和I κB- α mRNA 表達(dá)水平的影響

Fig.2 Effect of Mes on pathological changes in colonic tissue of ulcerative colitis rats.See Fig.1 for the rat treatment.Arrows in Fig.A show multiple ulcers of different sizes and infiltration of inflammatory cells in the mucosa and submucosa.±s，n=8.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

Tab.2 Effect of Mes on plasma tumor necrosis factor- α（TNF- α），interferon- γ（lFN- γ），interleukin 4（lL-4）and lL-13 contents and myeloperoxidase（MPO）activity in colon tissue of ulcerative colitis rats

與正常對(duì)照組相比，模型組Pxr，NF-κB p65和IκB-αmRNA水平均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），而NF-κBmRNA水平顯著上升（P＜0.01）；與模型組相比，模型+Mes組和模型+Mes+Rif組Pxr，NF-κB p65和IκB-αmRNA水平均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），NF-κBmRNA水平下降（P＜0.05），模型+Mes+Ket組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而與模型+Mes組相比，模型+Mes+Ket組中Pxr和IκB-αmRNA水平顯著下降（P＜0.05），模型+Mes+Rif組各炎癥因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

2.5 美沙拉嗪對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸PXR和p-P65蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠PXR蛋白表達(dá)降低，p-P65蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組大鼠相比，模型+Mes組和模型+Mes+Rif組PXR蛋白表達(dá)升高，而p-P65蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），模型+Mes+Ket組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型+Mes組相比，模型+Mes+Rif組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而模型+Mes+Ket組PXR蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），p-P65蛋白表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3）。

Tab.3 Effect of Mes on mRNA expressions of Pxr，NF- κB，NF- κB p65 and I κB- α in colon tissue of ulcerative colitis rats

Fig.3 Effect of Mes on PXR and p-P65 protein expressions in colon of ulcerative colitis rats.See Fig.1 for the rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.IA：intergated absorbance.±s，n=8.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group；△△P＜0.01，compared with model+Mes group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，PXR在UC大鼠中顯著降低，與在UC患者中的表達(dá)一致［13］。NF-κB作為一條經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，對(duì)誘發(fā)炎癥有重要作用。各種刺激因子會(huì)誘導(dǎo)IκB磷酸化，待IκB降解后可激活NF-κB，調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的合成與釋放，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展［14-15］。據(jù)報(bào)道，PXR和NF-κB之間的相互作用對(duì)炎癥因子的相關(guān)表達(dá)具有重要調(diào)控作用，NF-κB激活能抑制PXR活性，而PXR的激活可抑制NF-κB活性及其靶基因的表達(dá)［16-17］。如Garg 等［13］研究表明，PXR活化可抑制NF-κB信號(hào)通路，減輕炎癥，從而緩解腸上皮屏障功能障礙；Zhang等［17］研究表明，人參皂苷可通過(guò)調(diào)節(jié)PXR/NF-κB信號(hào)通路緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。

TNBS混合50%乙醇灌腸誘導(dǎo)UC大鼠模型是一種很成熟的造模方法［18-19］，本研究結(jié)果顯示，UC大鼠體質(zhì)量顯著下降，DAI指數(shù)明顯升高，且鏡下觀察結(jié)腸有充血潰爛，形成大面積潰瘍?cè)?，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［20］，提示造模成功。Mes作為臨床治療UC的常用藥物，其具體抗炎機(jī)制不清，本研究給予PXR激動(dòng)劑Rif后，PXR顯著升高，再給予Mes，發(fā)現(xiàn)UC的癥狀顯著改善，并且NF-κB及其下游促炎因子明顯下調(diào)；而先給予PXR抑制劑Ket，PXR表達(dá)水平顯著降低，再給予Mes，藥效降低，大鼠NF-κB及其下游促炎癥因子無(wú)顯著變化。說(shuō)明Mes對(duì)UC的治療效果很可能與PXR的表達(dá)水平相關(guān)，但Mes是否為PXR的底物尚不明確，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，Mes對(duì)UC的治療效果可能與PXR/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。本研究為臨床上使用Mes治療UC提供了更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。