段敬怡，許妍妍，王玉明，李遇伯

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617）

隨著中藥國(guó)際化進(jìn)程的推進(jìn)，中藥安全性已經(jīng)越來(lái)越引起社會(huì)廣泛關(guān)注。2017年，馬兜鈴酸致肝癌事件給中藥發(fā)展帶來(lái)極其惡劣的影響，亦提示當(dāng)前中藥毒性基礎(chǔ)研究存在兩大挑戰(zhàn)。首先，現(xiàn)有毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)多難以反映不良反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程，毒性信息碎片化；其次，中藥致毒的始動(dòng)因素，即致毒成分及其直接作用靶標(biāo)亦不清楚，其與機(jī)體最終的毒性效應(yīng)之間的聯(lián)系仍需探討。為探討以上難題，本文以確有肝毒性但毒性機(jī)制尚不清晰的補(bǔ)骨脂為例，借助有害結(jié)局路徑（adverse outcome pathway，AOP）概念，應(yīng)用自上而下“Top-down”策略，首先確定頂端可明確的有害結(jié)局（毒性），然后逐級(jí)闡述較低生物結(jié)構(gòu)層次的關(guān)鍵事件（毒性進(jìn)程拐點(diǎn)），最后，明確分子層面的相互作用，將分子起始事件（毒性始動(dòng)因素）與毒性表現(xiàn)相聯(lián)系，從而構(gòu)建AOP框架。結(jié)合中藥特殊性，靈活運(yùn)用組學(xué)等新方法，構(gòu)建中藥毒性進(jìn)程動(dòng)態(tài)機(jī)制的研究框架。本研究不僅為補(bǔ)骨脂（Fructus Psoraleae）的合理用藥提供指導(dǎo)，亦為中藥毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提出一條可模塊化研究的思路。

1 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析

1.1 基于有害結(jié)局路徑的毒性研究

2017年，馬兜鈴酸致肝癌事件引發(fā)海內(nèi)外廣泛關(guān)注及激烈爭(zhēng)論，暴露當(dāng)前亟需毒性動(dòng)態(tài)機(jī)制明確、始動(dòng)因素清晰的毒性早期發(fā)現(xiàn)策略［1］。針對(duì)21世紀(jì)毒性評(píng)價(jià)現(xiàn)狀，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）倡導(dǎo)并啟動(dòng)AOP概念框架發(fā)展計(jì)劃，即整合體外實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模型，構(gòu)建從分子起始事件到關(guān)鍵事件，再到有害結(jié)局等不同生物水平的反應(yīng)事件及事件之間的動(dòng)態(tài)聯(lián)系，從而為下一步藥物及化學(xué)品危險(xiǎn)評(píng)估及毒性防控提供有力證據(jù)［2-4］。圖1展示了AOP框架所包含的主要事件，包括分子起始事件即化合物與分子靶標(biāo)（蛋白或DNA）的相互作用和細(xì)胞、器官、機(jī)體水平甚至種群水平發(fā)生的變化［5-6］。該框架充分考慮化合物毒性進(jìn)程，對(duì)于闡釋藥物與毒性相關(guān)性、毒性機(jī)制及危險(xiǎn)度評(píng)估具有重要意義。

AOP概念一經(jīng)提出即引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注，目前在水體復(fù)合污染和化學(xué)藥物毒理學(xué)領(lǐng)域已有初步研究，常規(guī)可采用自下而上（Bottom-up）模式，即從一個(gè)已知的分子起始事件開(kāi)始，到中間的關(guān)鍵事件，再到個(gè)體或種群的有害結(jié)局的研究方式［7-8］。然而中藥毒性研究多呈碎片化特征，且中藥作用模式很難確定分子起始事件及毒性進(jìn)程的關(guān)鍵事件。根據(jù)中藥特殊性，可靈活采用“Top-down”策略，即從機(jī)體明確的毒性效應(yīng)出發(fā)，向中間低生物結(jié)構(gòu)層次的關(guān)鍵事件研究，并將毒性效應(yīng)與一個(gè)或多個(gè)分子起始事件相聯(lián)系，可用于中藥復(fù)雜體系的毒性機(jī)制模塊化研究。隨著分子生物學(xué)、組學(xué)技術(shù)、化學(xué)生物學(xué)研究的不斷深入，建立以動(dòng)態(tài)機(jī)制為基礎(chǔ)的中藥危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)將極大減少危險(xiǎn)度的不確定因素，亦是中藥安全性研究的終極目的之一［9］。

圖1 有害結(jié)局路徑（AOP）示意圖［5-6］.“Bottom-up”模式：由已知分子起始事件向有害結(jié)局研究；“Top-down”策略：自有害結(jié)局向相聯(lián)系的分子起始事件研究.

1.2 組學(xué)技術(shù)在中藥毒性中的研究

經(jīng)過(guò)10余年發(fā)展，代謝組學(xué)在毒理領(lǐng)域取得諸多突破，內(nèi)源性代謝物直接參與甚至調(diào)控多條重要代謝通路，而表型代謝物的改變能高靈敏地反饋機(jī)體內(nèi)毒性發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，從代謝通路動(dòng)態(tài)調(diào)控角度助推毒性的早期發(fā)現(xiàn)、潛在機(jī)制研究及防控靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)［10-12］。從毒性關(guān)聯(lián)的代謝生物標(biāo)志物入手，分析相關(guān)代謝過(guò)程和分子信號(hào)通路，再結(jié)合其他組學(xué)信息互補(bǔ)更有利于中藥毒性機(jī)制探索。串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽技術(shù)（tandem mass tag，TMT）或相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素標(biāo)記技術(shù)（isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ）標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，具有靈敏度高、適用范圍廣、高通量的優(yōu)勢(shì)，對(duì)于揭示毒性發(fā)生發(fā)展進(jìn)程及蛋白質(zhì)效應(yīng)靶點(diǎn)的篩選都具有重要意義［13-14］。代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相交匯，利用代謝組學(xué)能終端反映表型組的特點(diǎn)及蛋白質(zhì)組學(xué)靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)，獲得海量數(shù)據(jù)進(jìn)行多尺度模式分析，檢識(shí)毒性進(jìn)程的臨界階段，鑒定具有早期預(yù)警價(jià)值的“核心靶標(biāo)”，從而系統(tǒng)闡釋中藥“量-時(shí)-毒”動(dòng)態(tài)關(guān)系。

1.3 中藥致毒分子起始事件（直接靶標(biāo)）的研究

組學(xué)動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)的“核心靶標(biāo)”可能是效應(yīng)靶點(diǎn)，即直接靶標(biāo)經(jīng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白，而致毒成分的直接靶標(biāo)對(duì)于進(jìn)一步指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)用藥至關(guān)重要。近年來(lái)，化學(xué)生物學(xué)及計(jì)算化學(xué)逐漸應(yīng)用于中藥直接靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)，可采用化學(xué)生物學(xué)中藥物親和反應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定技術(shù)（drug affinity responsive target stability）［15］、親和色譜以及點(diǎn)擊化學(xué)等技術(shù)，其中點(diǎn)擊化學(xué)因其具備化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、易于模塊化和立體選擇性好等優(yōu)勢(shì)，對(duì)于中藥直接靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)及化合物與靶標(biāo)相互作用的闡釋都有重要意義［16］，已用于活性成分青蒿素［17］和姜黃素［18］靶標(biāo)的研究。“釣取”的靶點(diǎn)可采用分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)小分子與生物大分子結(jié)合模式，以增加直接靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)的準(zhǔn)確率［19］。

1.4 中藥肝毒性研究

近年來(lái)，有關(guān)中藥肝毒性的文獻(xiàn)報(bào)道日趨增多，明確報(bào)道肝毒性的中藥有何首烏、大黃、柴胡、雷公藤、黃藥子和補(bǔ)骨脂等70多種，對(duì)于中藥肝毒性的認(rèn)識(shí)主要集中在脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、CYP450酶代謝異常、線(xiàn)粒體功能失調(diào)、Ca2+濃度平衡破壞、免疫激活介導(dǎo)的炎癥因子釋放、肝腸循壞障礙和膽汁淤積等。補(bǔ)骨脂作為溫腎助陽(yáng)的常用中藥，在《中國(guó)藥典》收載20多種補(bǔ)骨脂中藥制劑，多個(gè)品種已有臨床不良反應(yīng)報(bào)道，然而其致肝毒性研究還處于初始階段，毒性成分主要集中在補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素等幾種成分，補(bǔ)骨脂毒性強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)呈顯著毒-量相關(guān)性和時(shí)-毒相關(guān)性，其毒性表現(xiàn)為膽汁淤積或肝脂肪變性［20-22］。

補(bǔ)骨脂化學(xué)成分復(fù)雜，然而其毒性機(jī)制及可控的毒作用靶點(diǎn)未見(jiàn)深入報(bào)道。在系統(tǒng)生物學(xué)和化學(xué)生物學(xué)發(fā)展迅猛的當(dāng)下，對(duì)其導(dǎo)致肝毒性發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行必要的深入研究，發(fā)現(xiàn)藥源性肝損傷進(jìn)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)或靶點(diǎn)，這對(duì)于后期篩選有效的干預(yù)藥物，制定合理防治措施，提高臨床應(yīng)用的安全性至關(guān)重要。

2 中藥毒性進(jìn)程動(dòng)態(tài)機(jī)制的研究思路

中藥安全性研究是制約中藥國(guó)際化和現(xiàn)代化的瓶頸，針對(duì)當(dāng)前中藥毒性研究現(xiàn)狀，借助AOP框架，以補(bǔ)骨脂為研究對(duì)象，構(gòu)建其致肝毒性AOP框架，為中藥毒性進(jìn)程動(dòng)態(tài)機(jī)制的闡明提供研究策略。研究思路的技術(shù)路線(xiàn)見(jiàn)圖2。

2.1 補(bǔ)骨脂致肝毒性有害結(jié)局（毒性）的確證

圖2 基于AOP的中藥毒性進(jìn)程動(dòng)態(tài)機(jī)制研究思路的技術(shù)路線(xiàn)（以補(bǔ)骨脂為例）.

依據(jù)臨床補(bǔ)骨脂大劑量中毒和小劑量長(zhǎng)期給藥致毒的特點(diǎn)，設(shè)置合理的給藥劑量和給藥時(shí)間，考察其致肝毒性特征，毒性考察指標(biāo)包括肝酶活性、肝組織病理特征等。根據(jù)不同劑量補(bǔ)骨脂作用于動(dòng)物檢測(cè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)，繪制肝毒性關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)與劑量和時(shí)間的“量-時(shí)-毒”變化曲線(xiàn)，從而明確補(bǔ)骨脂致肝毒性的有害結(jié)局。已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂提取液可造成肝毒性，毒性程度與補(bǔ)骨脂的給藥劑量和時(shí)間成正相關(guān)（待發(fā)表）。

2.2 補(bǔ)骨脂致肝毒性關(guān)鍵事件（毒性進(jìn)程拐點(diǎn)）的確證

以2.1不同實(shí)驗(yàn)組的肝組織樣本為研究對(duì)象，進(jìn)行代謝組學(xué)和定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，構(gòu)建共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通路，確定毒性動(dòng)態(tài)進(jìn)程。采用Western印跡法和定量PCR等方法驗(yàn)證關(guān)鍵蛋白在基因水平和蛋白水平的變化，通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)目標(biāo)信號(hào)通路，初步發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂致肝毒性關(guān)鍵事件。隨后再借助基因敲減、基因過(guò)表達(dá)等基因改造技術(shù)，反向驗(yàn)證毒性進(jìn)程中關(guān)鍵蛋白與有害結(jié)局的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，明確毒性進(jìn)程“核心靶標(biāo)”，并確定補(bǔ)骨脂致肝毒性關(guān)鍵事件。

無(wú)靶向代謝組學(xué)和TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)顯著變化的代謝物和蛋白質(zhì)，代謝物包括膽汁酸類(lèi)物質(zhì)、谷胱甘肽和次黃嘌呤等小分子物質(zhì)，相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)主要包括膽固醇7-α-單加氧酶、中性膽固醇酯水解酶1和丙酮酸激酶等。組學(xué)交匯分析結(jié)果顯示，關(guān)鍵事件主要涉及膽汁淤積、能量代謝、氧化應(yīng)激等方面，膽汁分泌、谷胱甘肽代謝和丙酮酸代謝等代謝途徑在其中起重要作用（待發(fā)表）。

2.3 補(bǔ)骨脂致肝毒性分子起始事件（直接靶標(biāo)）的確證

毒性進(jìn)程“核心靶標(biāo)”可能含有毒性發(fā)生發(fā)展的效應(yīng)蛋白，還需尋找補(bǔ)骨脂致肝毒性的分子起始事件。基于化學(xué)生物學(xué)策略，點(diǎn)擊化學(xué)已有不少報(bào)道用于毒性成分-靶標(biāo)相互作用研究［23-25］，為直接靶標(biāo)的確證提供方法學(xué)依據(jù)。首先根據(jù)文獻(xiàn)及質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)確定補(bǔ)骨脂中主要化學(xué)成分，采用體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)及肝相關(guān)生化指標(biāo)等方法評(píng)估補(bǔ)骨脂化學(xué)成分的毒性，從而篩選補(bǔ)骨脂關(guān)鍵毒性成分。然后基于點(diǎn)擊化學(xué)，合成炔基修飾的小分子探針用以共價(jià)結(jié)合靶標(biāo)蛋白，結(jié)合后的小分子探針可與疊氮修飾的報(bào)告基團(tuán)發(fā)生“點(diǎn)擊”反應(yīng)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、質(zhì)譜解析鑒定該小分子的靶標(biāo)，初步篩選毒性成分的直接靶標(biāo)，每個(gè)毒性成分可能有多個(gè)直接靶標(biāo)。隨后采用分子對(duì)接技術(shù)，模擬毒性成分與直接靶標(biāo)的結(jié)合模式，并與2.2毒性進(jìn)程中的“核心靶標(biāo)”進(jìn)行蛋白互作分析，篩選關(guān)聯(lián)性較好的直接靶標(biāo)蛋白。最后將毒性成分作用于肝細(xì)胞，Western印跡法和定量PCR等方法驗(yàn)證直接靶標(biāo)與關(guān)鍵事件及有害結(jié)局的關(guān)聯(lián)，確證補(bǔ)骨脂致肝毒性分子起始事件。

2.4 補(bǔ)骨脂致肝毒性有害結(jié)局路徑框架的構(gòu)建

基于AOP構(gòu)建的基本原則［2］，以及已有小分子化合物構(gòu)建AOP框架的示例［26-27］?？偨Y(jié)歸納補(bǔ)骨脂致肝毒性數(shù)據(jù)，層級(jí)遞進(jìn)，可從機(jī)體水平描述補(bǔ)骨脂致肝毒性的有害結(jié)局，分子、細(xì)胞和器官水平闡釋肝毒性關(guān)鍵事件，從毒性成分與蛋白質(zhì)大分子的直接相互作用的角度闡釋分子起始事件。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞通路以及分子起始事件、關(guān)鍵事件的基因改造等可進(jìn)一步確定有害結(jié)局、關(guān)鍵事件、分子起始事件之間的關(guān)系，從而構(gòu)建補(bǔ)骨脂致肝毒性AOP框架。

通過(guò)建立基于AOP框架的中藥毒性進(jìn)程動(dòng)態(tài)機(jī)制研究策略，為中藥臨床精準(zhǔn)用藥提供依據(jù)。該研究不僅僅深入闡釋補(bǔ)骨脂的致毒機(jī)制，更為中藥毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究提出一條可模塊化研究的方法。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著中藥及其制劑在國(guó)內(nèi)外的廣泛使用，其安全問(wèn)題日益突顯，并成為影響中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的關(guān)鍵因素之一。然而中藥成分復(fù)雜，致毒的始動(dòng)因素尚不清楚，碎片化毒性研究尚無(wú)法反映毒性發(fā)生發(fā)展的動(dòng)態(tài)過(guò)程。本文提出了一套“Top-down”的“有害結(jié)局-關(guān)鍵事件-分子起始事件”的中藥毒性進(jìn)程動(dòng)態(tài)機(jī)制研究新策略?？紤]到中藥的特殊性，將組學(xué)技術(shù)和化學(xué)生物學(xué)應(yīng)用到中藥毒性研究中，從距離毒性終端表型最近的代謝生物標(biāo)志物入手，根據(jù)其涉及的代謝過(guò)程和分子信號(hào)通路，整合定量蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)其調(diào)控“核心靶標(biāo)”，避免毒性進(jìn)程信息片面化；采用化學(xué)生物學(xué)手段，靶向發(fā)現(xiàn)毒性直接靶標(biāo)。以毒性機(jī)制尚不清晰的補(bǔ)骨脂為研究對(duì)象，構(gòu)建補(bǔ)骨脂致肝毒性AOP框架，深入闡釋了其致肝毒機(jī)制，可為補(bǔ)骨脂的合理用藥提供指導(dǎo)，同時(shí)為中藥毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的研究提供新的思路。