崔勤濤，王俊華，劉曉晨，王學(xué)惠，馬海英，蘇國寶

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管外科，河南 新鄉(xiāng) 453000）

多種心肌疾病中均存在心肌細胞凋亡的現(xiàn)象，它是導(dǎo)致心臟功能惡化、心室重塑、各種慢性心力衰竭的主要因素；抑制心肌細胞凋亡、減輕心臟重塑、改善心肌細胞生存環(huán)境是治療心肌疾病的重要措施［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注損傷［4］、心肌梗死［5］和心力衰竭等過程中都會有心肌細胞凋亡的發(fā)生，引起細胞氧化的因素可以誘導(dǎo)細胞的凋亡，而抗氧化劑則可抑制氧化誘導(dǎo)的細胞凋亡［6］。在這些病理過程中，由于心肌活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基產(chǎn)生增加，使得其與氧化應(yīng)激關(guān)系密切［7］。氧化應(yīng)激是指由于活性氧過量生成或細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損，導(dǎo)致超氧陰離子O2-和H2O2等氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集，從而對細胞產(chǎn)生多種毒性作用的病理狀態(tài)。研究表明，中藥丹參主要提取成分丹酚酸A（salvianolic acid A，Sal A）具有顯著的抗氧化和抗細胞凋亡作用，其抗氧化活性對心肌損傷具有顯著的保護作用［8-9］，但有關(guān)Sal A能否對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激具有保護作用尚缺乏可靠證據(jù)。本研究利用LPS誘導(dǎo)建立H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激性損傷模型，探討Sal A對LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激性損傷H9c2心肌細胞存活和凋亡的保護作用，以及對蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/起始因子4E結(jié)合蛋白（protein kinase B/mammlain target of Rapamycin/eIF4E-binding protein 1，AKT/mTOR/4EBP 1）通路相關(guān)蛋白表達的影響，為Sal A臨床治療心肌損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

Sal A（Sigma公司，美國）；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰酶（Gibco公司，美國）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（PIERCE公司，美國）；MatrigelTM底膜基質(zhì)（BD公司，美國）；兔抗大鼠胱天蛋白酶3、活化胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶9、存活蛋白、Bax/Bcl-2、mTOR、磷酸化mTOR（p-mTOR）、AKT、p-AKT、4EBP1和p-4EBP1單克隆抗體（NEB公司，美國）；HRP標記的山羊抗兔二抗（Santa Cruz公司，美國）；5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷試劑盒和線粒體膜電位JC-1檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Annexin V-FITC/碘化丙錠（propidium iodide，PI）細胞凋亡試劑盒（中國凱基生物公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國）空氣恒溫搖床（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）；高速低溫離心機（Beckman公司，美國）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國）；電泳槽，電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad公司，美國）；FACS Vantage SE流式細胞儀（BD公司，美國）；電熱恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械七廠）；凝膠成像系統(tǒng)GDS-800 UVP（UVP公司，美國）；ChemiDoc XRS凝膠/發(fā)光圖像分析儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 細胞和細胞培養(yǎng)

H9c2心肌細胞購自上海中國科學(xué)院細胞庫。H9c2心肌細胞在補充有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長。所有細胞均在含有5%CO2的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。細胞匯合率達到85%以上時用0.25%胰酶進行消化傳代。取第3～8代細胞用于實驗。

1.3 細胞分組處理

H9c2心肌細胞分5組：細胞對照組，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換為無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加LPS 1 mg·L-1繼續(xù)孵育24 h；藥物處理組，H9c2細胞用含Sal A 5，10和20 mg·L-1DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后加LPS 1 mg·L-1繼續(xù)孵育24 h。

1.4 5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（EdU）染色觀察H9c2心肌細胞存活

取11..33處理的各組細胞 ，用EdU 50 μmol·L-1培養(yǎng)12 h，用4%多聚甲醛固定細胞30 min和5%甘氨酸培養(yǎng)5 min，PBS洗滌和0.5%Triton X-100破膜后，用抗-EdU抗體孵育30 min，再用Hoechst-33342 5 mg·L-1染色30 min，在熒光倒置顯微鏡下觀察并照相，計算每組EdU陽性細胞數(shù)（活細胞數(shù)）占細胞總數(shù)的比例。EdU陽性細胞率（%）=（EdU陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。

1.5 流式細胞術(shù)檢測H9c2心肌細胞凋亡

取1.3處理H9c2心肌細胞，以每孔1×106細胞接種至6孔板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。之后分別收集每孔內(nèi)的細胞。按凋亡檢測試劑盒說明書操作，用Annexin V-FITC和PI雙染，于流式細胞儀檢測凋亡率。

1.6 試劑盒檢測細胞SOD和LDH活性及MDA和GSH的含量

取1.3處理的H9c2心肌細胞，分別采用SOD，MDA，LDH和GSH試劑盒測定H9c2心肌細胞上清液SOD，LDH活性和MDA，GSH的含量。操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.7 Western印跡法檢測AKT，mTOR和4EBP1蛋白磷酸化水平

使用裂解緩沖液裂解1.3分組處理細胞，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。含有20mg蛋白質(zhì)的樣品在10%SDS-PAGE中分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗（1∶1000）于4℃封閉過夜，第2天加入對應(yīng)二抗（1∶5000），室溫封閉1 h，最后滴加電光學(xué)發(fā)光（electro-chemluminescence，ECL），設(shè)置曝光參數(shù)，凝膠成像系統(tǒng)拍照，用凝膠定量分析軟件Gel-Pro analyzer4.0對蛋白條帶積分吸光度值進行半定量分析。以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度比值表示目的蛋白相對表達水平。以p-AKT/AKT，p-4EBP1/4EBP1，p-mTOR/mTOR比值表示蛋白磷酸化水平。

1.8 JC-1染色法檢測線粒體膜電位（ΔΨm）

取1.3處理的H9c2心肌細胞，用PBS洗滌，加入JC-1 5 μmol·L-1，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，然后用PBS洗滌細胞并使用流式細胞儀分析，使用Novoexpress軟件分析數(shù)據(jù)，用紅綠熒光的熒光強度比值表示膜電位。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 丹酚酸A對LPS誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞存活的影響

如圖1所示，細胞對照組可見大量EdU紅色標記（陽性）細胞。模型組EdU紅色標記的細胞明顯減少。Sal A 5，10和20 mg·L-1組EdU紅色標記的細胞較模型組明顯增多。與細胞對照組比較，模型組和Sal A 5 mg·L-1組EdU陽性細胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。與模型組比較，Sal A 5，10和20 mg·L-1組EdU陽性細胞數(shù)顯著升高（P＜0.05）。

Fig.1 Effect of salvianolic acid A（Sal A）on survival of H9c2 cardiomyocytes induced by lipopolysaccharide（LPS）（EdU stainning）.H9c2 cells were cultured in Sal A 5，10，and 20 mg·L-1for 24 h，and then incubated with LPS 1 mg·L-1for 24 h.±s，n=9.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with model（LPS）group.

2.2 丹酚酸A對H9c2心肌細胞凋亡的影響

如圖2所示，與細胞對照組細胞凋亡率相比，模型組和Sal A 5 mg·L-1組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，Sal A 5，10和20 mg·L-1組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。

Fig.2 Effect of Sal A on apoptosis of H9c2 cardiomyocytes induced by LPS.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=9.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.3 丹酚酸A對LPS誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞培養(yǎng)上清中SOD和LDH活性及MDA和GSH含量的影響

如表1所示，與細胞對照組比較，模型組H9c2心肌細胞上清中SOD活性顯著降低（P＜0.05），MDA和GSH含量及LDH活性均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，Sal A 10和20 mg·L-1組SOD活性顯著升高（P＜0.05），MDA和GSH含量及LDH活性均顯著降低（P＜0.05）。

Tab.1 Effect of Sal A on superoxide dismutase（SOD）and lactate dehydrogenase（LDH）activities and malondialdehyde（MDA）and glutathione（GSH）contents in supernatant of LPS-induced H9c2 myocardial cell culture

2.4 丹酚酸A對LPS誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

如圖3所示，與細胞對照組比較，模型組和Sal A 5 mg·L-1組活化胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3、活化胱天蛋白酶9/胱天蛋白酶9和Bax/Bcl-2蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，Sal A 5，10和20 mg·L-1組活化胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3、活化胱天蛋白酶9/胱天蛋白酶9和Bax/Bcl-2蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）。與對細胞照組比較，模型組和Sal A 5 mg·L-1組存活蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，Sal A 5，10和20 mg·L-1組存活蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。

2.5 丹酚酸A對LPS誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞AKT/mTOR/4EBP1磷酸化水平的影響

如圖4所示，與細胞對照組比較，模型組和Sal A 5 mg·L-1組AKT，mTOR和4EBP1磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，Sal A 10和20 mg·L-1組AKT，mTOR和4EBP1磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05）。

2.6 丹酚酸A對LPS誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞線粒體膜電位的影響

Fig.3 Effect of Sal A on expressions of apoptosis-related proteins in H9c2 cardiomyocytes induced by LPS.See Fig.1 for the cell treatment.B-E were the semi-quantitative results of A.±s，n=9.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with model group.

如圖5所示，與細胞對照組比較，模型組和Sal A 5 mg·L-1組線粒體膜電位顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，Sal A 5，10和20 mg·L-1組線粒體膜電位顯著降低（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of Sal A on phosphorylation of protein kinase B/mammlain target of Rapamycin/elF4E-binding protein1（AKT/mTOR/4EBP1）in H9c2 cardiomyocytes induced by LPS.See Fig.1 for the cell tretment.B-D were the semi-quantitative results of A.±s，n=9.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with model group.

Fig.5 Effect of Sal A on mitochondrial membrane potential of H9c2 cardiomyocytes induced by LPS.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=9.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with model group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，Sal A處理后EdU陽性細胞數(shù)升高，表明Sal A提高了LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞存活率。因此，本研究結(jié)果提示，Sal A能保護H9c2細胞免受LPS誘導(dǎo)的損傷。

凋亡在氧化應(yīng)激相關(guān)性心血管疾病的病理進展中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在多柔比星誘導(dǎo)的大鼠心臟毒性模型中，存活蛋白對心肌細胞凋亡的進展具有保護作用［11］。研究證實，Sal A可通過下調(diào)Bax/Bcl-2的比值，阻止線粒體釋放細胞色素c并最終抑制胱天蛋白酶3的表達，從而保護H9c2細胞免受三氧化二砷誘導(dǎo)的損傷［8］。同樣，Sal A預(yù)處理后活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3以及Bax/Bcl-2表達下調(diào)，存活蛋白的蛋白水平上調(diào)，從而抑制細胞凋亡［10］。本研究結(jié)果顯示，Sal A處理后使活化胱天蛋白酶3、活化胱天蛋白酶9和Bax/Bcl-2蛋白水平下調(diào)，存活蛋白的蛋白水平上調(diào)，表明Sal A對內(nèi)源性凋亡途徑起到了調(diào)節(jié)作用。因此本研究結(jié)果提示，Sal A可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性凋亡途徑，從而抑制LPS誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡。

凋亡早期可能造成因線粒體膜去極化而引起ΔΨm下降。在凋亡信號的刺激下，ΔΨm的下降出現(xiàn)在凋亡的特征性細胞核改變之前，而ΔΨm的下降必然引起凋亡［11］。通過AMP預(yù)處理后維持和恢復(fù)線粒體膜去極化，抑制線粒體膜電位的丟失［12］。研究發(fā)現(xiàn)，在Sal A處理過的細胞中檢測到細胞線粒體膜通透性的降低和ΔΨm的增加［10］。Sal A可保護線粒體膜電位的丟失，抑制H9c2心肌細胞凋亡［8］。本研究結(jié)果顯示，Sal A能使H9c2心肌細胞線粒體膜電位去極化基本恢復(fù)，表明Sal A能夠通過穩(wěn)定LPS誘導(dǎo)的心肌細胞線粒體膜電位，抑制ΔΨm下降，具有線粒體保護作用。

維持氧化平衡可減少由于內(nèi)源性抗氧化而造成的氧化損傷。LDH是一種可靠的細胞毒性指標，細胞的內(nèi)源性抗氧化能力與SOD，MDA和GSH有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，通過減輕缺氧誘導(dǎo)的LDH釋放增加可明顯提高H9c2心肌細胞的存活率［13］。GSH的消耗導(dǎo)致氧化損傷［14］。而SOD可以中和自由基，保護細胞免受活性氧損傷［15］。有報道稱，Sal A可通過保留線粒體功能來保護心肌細胞免受低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的損傷［16］。此外，Sal A通過降低MDA水平、提高SOD活性從而減少氧化損傷［17］。本研究結(jié)果顯示，Sal A處理后SOD活性明顯升高，MDA和GSH含量以及LDH活性均明顯降低，提示Sal A可能通過改變LPS誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞的內(nèi)源性抗氧化能力來降低氧化損傷。

AKT/mTOR信號通路在調(diào)控細胞的增殖、存活和代謝等方面發(fā)揮著重要作用，同時還調(diào)控蛋白合成和細胞周期［18］。研究發(fā)現(xiàn)，Sal A通過激活A(yù)KT/mTOR信號來保護機體免受氧化應(yīng)激［19］。通過Sal A的預(yù)處理能增加mTOR和4EBP1的磷酸化水平，AKT/mTOR/4EBP1信號通路在腎缺血再灌注損傷過程中對細胞抗氧化應(yīng)激具有保護作用［20］。本研究結(jié)果顯示，Sal A使AKT和mTOR磷酸化水平明顯升高。因此，本研究結(jié)果提示Sal A可能通過激活A(yù)KT/mTOR/4EBP1信號通路，緩解LPS誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激。

綜上所述，本研究利用LPS誘導(dǎo)損傷建立H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激性損傷模型，通過Sal A激活A(yù)KT/mTOR/4EBP1的通路，減少心肌細胞的凋亡率；降低心肌細胞線粒體膜電位的下降速度，減緩LPS誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激，表明Sal A對LPS造成的心肌細胞損傷具有保護作用，為Sal A用于臨床治療心肌損傷提供實驗依據(jù)。