李鳳祥，張 弛，唐 瑤，李宇杰，張林聰，彭雙清，郭家彬，康金森

（1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.中國人民解放軍疾病預防控制中心，北京 100071）

曲格列酮（troglitazone）是一種噻唑烷二酮類胰島素增敏劑，臨床主要用于治療2型糖尿病和胰島素抵抗，其藥理學作用機制主要是通過競爭性激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ），調(diào)節(jié)胰島素反應性基因的轉(zhuǎn)錄。但曲格列酮上市后發(fā)現(xiàn)，其具有嚴重的肝毒性，2000年被美國食品藥品管理局（FDA）撤市。FILION等［1］研究顯示，曲格列酮具有引起心臟衰竭［2］、心肌肥大［3-4］和充血性心力衰竭等心血管疾病風險，提示曲格列酮具有潛在的心臟毒性，但其心臟毒性特征及機制均有待闡明。線粒體是細胞能量代謝的主要場所，也是細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要來源。研究提示，線粒體是曲格列酮誘發(fā)肝毒性的重要靶位，曲格列酮通過損傷肝線粒體DNA，激活氧化應激而誘導肝線粒體功能障礙［5］。心肌細胞線粒體約占心肌總體積的40%，且這些線粒體十分活躍，在維持心肌細胞功能、氧化應激穩(wěn)態(tài)和損傷修復等生命活動中發(fā)揮至關重要的作用。但曲格列酮對心肌細胞線粒體功能的影響至今尚不清楚。

近年來研究提示，曲格列酮的毒作用與自噬密切相關［6-7］。自噬是細胞內(nèi)蛋白分解代謝的一種過程，通過吞噬受損的細胞器或錯誤折疊的蛋白以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［8］。然而，自噬的過度激活會導致細胞內(nèi)的正常成分被降解，激活細胞Ⅱ型程序性死亡。越來越多的研究提示，自噬在多種藥物誘導的心臟毒性中發(fā)揮重要作用。為此，本研究擬采用體外培養(yǎng)的人源心肌細胞揭示曲格列酮所誘導的心肌細胞毒性特征，并從線粒體氧化應激和自噬角度探討其潛在的毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

曲格列酮（貨號3114，英國TOCRIS公司）；DMEM細胞培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；青霉素和鏈霉素（美國Hyclone公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（中國碧云天公司）；TMRM和CM-H2DCFDA探針（美國Invitrogen公司）；Hoechest 33342探針（美國Sigma公司）；一抗：兔抗人微管相關蛋白Ⅰ/Ⅱ輕鏈3（microtubule-associated proteinⅠ/Ⅱlight chain 3，LC-3Ⅰ/Ⅱ）多克隆抗體（貨號12741S）和兔抗人脂質(zhì)體1/p62（sequestosome-1/p62，SQSTM1/p62）多克隆抗體（貨號 39749S）（美國Cell Signaling公司）；抗GAPDH抗體（Proteintech公司）；HRP標記山羊抗兔IgG抗體（二抗）（美國Invitrogen公司）。

JJT-1300超凈工作臺（北京亞泰科?。?；MCO-18AIC二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；MK3多功能酶標儀（美國Thermo公司）；CKX41倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；5200化學發(fā)光成像系統(tǒng)（中國Tanon公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組處理

人成年的心室樣心肌細胞系AC16購自美國American Type Cell Culture公司。AC16細胞常規(guī)培養(yǎng)：AC16細胞接種于含新鮮DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS+雙抗）的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到約80%時進行傳代。取對數(shù)生長期的AC16細胞，胰酶消化、重懸，以每孔5000個細胞的密度接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后分別加入曲格列酮0，5，10，20和40 μmol·L-1孵育24 h。

1.3 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)

取1.2分組處理的細胞，置于CKX41倒置顯微鏡下觀察每組細胞的形態(tài)變化并采集圖片。

1.4 CCK-8法檢測細胞存活率

取1.2分組處理的細胞，移除培養(yǎng)板中含藥培養(yǎng)基，于每孔加100 μL CCK-8工作液，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育50 min，用酶標儀檢測450 nm波長下的各孔吸光度（A450nm），計算細胞存活率。細胞存活率（%）=給藥組A450nm/對照組A450nm×100%。

1.5 漏出法檢測LDH釋放量

取1.2分組處理的細胞，距給藥終點前30 min，在最大酶活性組加LDH釋放劑10 μL，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育至給藥終點。分別取各孔上清液80 μL，加入到一個新的96孔板相應孔中，各孔分別再加LDH檢測工作液40 μL?；靹?，室溫避光孵育30 min。用酶標儀檢測490 nm波長下的吸光度（A490nm），計算細胞LDH釋放量。LDH釋放量（%）=（給藥組A490nm-對照組A490nm）/（細胞最大酶活性組A490nm-對照組A490nm）×100%。

1.6 高內(nèi)涵活細胞成像法檢測線粒體膜電位和細胞ROS含量

取經(jīng)1.4檢測細胞存活率≥40%的1.2分組處理的細胞，用預熱至37℃的1×PBS分別配制含有細胞核染料 Hoechst33342（1 μmol·L-1）和線粒體膜電位染料TMRM（100 nmol·L-1），及含有細胞核染料 Hoechst33342（1 μmol·L-1）和全細胞活性氧染料CM-H2DCFDA（10 μmol·L-1）的混合活細胞染料。每孔用100 μL的1×PBS輕輕洗滌1次，分別加入100 μL混合活細胞染料，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中染色30 min，再用100 μL 1×PBS輕輕洗滌2次，加100 μL 1×PBS，采用高內(nèi)涵活細胞成像系統(tǒng)采集圖片并分析每組的平均熒光強度。

1.7 Western印跡法檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和P62蛋白表達水平

取對數(shù)生長期的AC 16細胞接種于60 mm皿中，分別給予曲格列酮0，0.2，1，5，10和20 μmol·L-1處理24 h后，用1×PBS輕輕洗滌3次，加入RIPA裂解液100 μL，冰上裂解40 min，12 000×g離心20 min。取上清，采用BCA法進行蛋白定量。等量樣品經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4℃搖床過夜（LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ和SQSTM1/P62的稀釋倍數(shù)1∶1000），二抗抗體室溫作用 1 h（稀釋倍數(shù) 1∶10 000），使用ECL超敏發(fā)光液在成像系統(tǒng)上顯影。Image J軟件分析條帶積分吸光度值，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值表示蛋白的相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 曲格列酮對AC16細胞形態(tài)學的影響

如圖1所示，細胞對照組的AC16細胞生長狀態(tài)良好，細胞輪廓清晰，多為細胞質(zhì)飽滿的長梭形或多角形（圖1A和1F）。曲格列酮5 μmol·L-1組（圖1B和1G）細胞形態(tài)無明顯變化，存在極少量的細胞凋亡；10 μmol·L-1組（圖1C，1H）細胞呈輕微程度的細胞質(zhì)皺縮，少量細胞凋亡；20 μmol·L-1組（圖1D和1I）細胞胞體收縮明顯，細胞間連接明顯變得稀疏，培養(yǎng)基中漂浮的死細胞數(shù)量明顯增多；40 μmol·L-1組（圖1E和1J），細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯改變，并伴有大面積脫落死亡。

Fig.1 Effect of troglitazone on cell morphology of AC16 cells.The AC16 cells were treated with troglitazone at the concentrations of 0，5，10，20 and 40 μmol·L-1for 24 h.F-G：enlarged view of A-E，respectively.

2.2 曲格列酮對AC16細胞存活率和LDH漏出的影響

如表1所示，曲格列酮0，5，10，20和40 μmol·L-1作用于AC16細胞24 h后，細胞存活率隨著給藥濃度的增加而明顯降低，IC50約為（27.0±3.0）μmol·L-1。與細胞對照組相比，曲格列酮10 μmol·L-1細胞存活率顯著降低（P＜0.05）；40 μmol·L-1時，細胞生存率降至20%以下，提示細胞出現(xiàn)大量死亡。與細胞對照組相比，曲格列酮20和40 μmol·L-1組，LDH釋放量分別增加了（70±10）%和（278±40）%，表明曲格列酮可損傷膜完整性致LDH釋放量增加。

Tab.1 Effect of troglitazone on cell viability and layered double hydroxide（LDH）leakage of AC16 cells

2.3 曲格列酮對AC16細胞線粒體膜電位的影響

如圖2所示，曲格列酮可導致細胞線粒體出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂，TMRM熒光強度降低。定量分析結(jié)果表明，在曲格列酮濃度≥5 μmol·L-1時，膜電位呈濃度依懶性降低（r=-0.945，P＜0.05）。表明曲格列酮可濃度依賴性地誘導心肌細胞線粒體功能紊亂。

2.4 曲格列酮對AC16細胞ROS含量的影響

如圖3所示，與細胞對照組相比，當曲格列酮≥5 μmol·L-1時，細胞內(nèi)ROS含量呈顯著性上升趨勢 （P＜0.05）。提示曲格列酮處理可明顯誘導AC16心肌細胞ROS生成增加。

Fig.2 Effect of troglitazone on mitochondrial membrane potential of AC16 cells detected by TMRM fluorescent staining.The AC116 cells were treated with troglitazone for 24 h.A：TMRM（red）and Hoechst33342（blue）staining（scale bar=50 μm）.B：the quantitative result of TMRM fluorescence intensity（FI）.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

Fig.3 Effect of troglitazone on intracellular ROS in AC16 cells detected by CM-H2DCFDA fluorescent staining.See Fig.2 for the cell treatment.A：CM-H2DCFDA（green）and Hoechst33342（blue）staining.B：the quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

2.5 曲格列酮對AC16心肌細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和P62蛋白表達的影響

如圖4所示，與細胞對照組比較，AC16細胞給予不同濃度的曲格列酮處理24 h后，LC3-Ⅱ蛋白表達呈上調(diào)趨勢。曲格列酮≥5 μmol·L-1可明顯增加自噬標志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（P＜0.05）。曲格列酮在10 μmol·L-1可顯著上調(diào)自噬流標志蛋白P62的表達水平（P＜0.05）。

3 討論

Fig.4 Effect of troglitazone on protein expressions of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ（A，B）and P62（A，C）in AC16 cells by Western blotting.The AC16 cells were treated with troglitazone 0，0.2，1，5，10 and 20 μmol·L-1for 24 h.B and C：The semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

本研究發(fā)現(xiàn)，當曲格列酮濃度＞10 μmol·L-1時，AC16心肌細胞的胞質(zhì)明顯皺縮，培養(yǎng)基內(nèi)漂浮的死細胞數(shù)目增多，細胞存活率顯著下降，LDH釋放量增加，且呈濃度依賴性，提示曲格列酮對AC16細胞有毒性作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度曲格列酮處理AC16細胞24 h后，線粒體膜電位下降，全細胞ROS含量上升，自噬標志蛋白LC3-Ⅱ和P62的表達均顯著上調(diào)，表明曲格列酮可濃度依賴性地引起AC16細胞凋亡和線粒體功能障礙，其機制與線粒體氧化應激和自噬體降解受阻有關。

噻唑烷二酮類藥物中以曲格列酮的肝線粒體毒性作用最強［9］，羅格列酮和吡格列酮因增加用藥者心血管疾病等風險而受到特殊警告［10］。研究提示，曲格列酮毒性作用機制可能與其誘導ROS生成有關，過量ROS不僅可以改變基因和蛋白表達，影響細胞的功能與表型，還可以攻擊細胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等重要成分，抑制線粒體生物合成，進一步加劇線粒體功能障礙，最終引發(fā)細胞的凋亡［11］。本研究結(jié)果顯示，給予曲格列酮處理后的AC16細胞線粒體膜電位降低，全細胞ROS含量增加，提示曲格列酮對AC16細胞毒作用可能通過激活線粒體途徑促進細胞的氧化應激損傷。

自噬主要包括自噬體的形成及自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，最終與內(nèi)容物一起被降解［12］。當自噬發(fā)生時，LC3-Ⅰ被脂質(zhì)化為LC3-Ⅱ，與自噬小泡結(jié)合形成自噬體。因此，LC3-Ⅱ或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與自噬體數(shù)量呈正相關［13］。另外，選擇性自噬底物蛋白P62通過與自噬體膜上的LC3-Ⅱ相互作用，形成自噬溶酶體將受損細胞器降解［14］。P62蛋白的積累通常被認為是自噬體與溶酶體結(jié)合受到阻礙［15-16］。本研究結(jié)果表明，曲格列酮在10和20 μmol·L-1可明顯上調(diào) AC16細胞中 LC3-Ⅱ的表達水平，增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，提示曲格列酮可誘導AC16細胞自噬的發(fā)生。然而，P62蛋白表達水平的上調(diào)，提示曲格列酮阻滯了AC16細胞中自噬體與溶酶體的融合，導致自噬體堆積。MA等［17］的研究也證實了此研究結(jié)果，自噬流受阻所引發(fā)的自噬體堆積會增加ROS的產(chǎn)生，改變線粒體的膜通透性，導致心肌細的凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，曲格列酮引起的心肌細胞損傷與線粒體氧化應激和自噬體降解受阻密切相關。上述發(fā)現(xiàn)不僅能增加對噻唑烷二酮類藥物致心臟毒性的認識，同時也為探討氧化應激與自噬調(diào)節(jié)在預防及治療噻唑烷二酮類藥物引起的心臟毒性中的潛在臨床應用價值提供重要科學依據(jù)和實驗基礎。