字友梅，黃 琰，張 媛，王莉華，呂國(guó)慶，郭 燕，吳 隼

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液一病區(qū)，河南 衛(wèi)輝 453100）

淋巴瘤是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，也是最常見的血液惡性腫瘤之一。T細(xì)胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤的一種亞型，是一種較為罕見的疾病，僅占所有淋巴瘤的5%～10%，但在我國(guó)卻顯示較高的患病率（23%～27%）［1］。但對(duì)其分子發(fā)病機(jī)制了解甚少，且治愈率低，常規(guī)化療后有16%～41%患者出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)［2］，急需新治療策略?；熕幬锏幕咎攸c(diǎn)是殺傷增殖活躍的腫瘤細(xì)胞，其主要作用于增殖細(xì)胞中的各種代謝途徑，如核酸代謝，DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和呼吸鏈代謝等［3］。有效的化療藥物可引起細(xì)胞凋亡，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，但很多腫瘤細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生耐藥性，具有抗凋亡作用［4-5］。探尋T淋巴瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制，對(duì)T淋巴瘤的治療具有重要的參考價(jià)值。小檗堿（黃連素，berberine，BBR）是一種提取于中藥黃連、黃柏和三顆針等植物的異喹啉生物堿。BBR主要用于治療敏感病原菌所致的胃腸炎、細(xì)菌性痢疾等胃腸道感染，也可用于治療眼結(jié)膜炎、化膿性中耳炎等。此外，臨床前研究發(fā)現(xiàn)，BBR具有止瀉、降壓、抗心律失常、降低膽固醇和抗菌消炎等作用。有報(bào)道BBR可誘導(dǎo)乳腺癌、卵巢癌和甲狀腺癌等腫瘤細(xì)胞的凋亡［6-8］，預(yù)測(cè)其可誘導(dǎo)T淋巴瘤細(xì)胞凋亡。GOTO等［9］報(bào)道，BBR可抑制原發(fā)性積液性淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，但BBR對(duì)T淋巴瘤細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制尚不清楚。本研究主要探討B(tài)BR對(duì)T淋巴瘤細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制，以期為T淋巴瘤細(xì)胞的治療提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

BBR（HPLC≥98%，上海純優(yōu)生物科技有限公司，貨號(hào)：P1003），多柔比星（doxorubicine，Dox，HPLC≥98%，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)：ml22505-1），含 L-谷氨酰胺 RPMI1640 培養(yǎng)液（上海滬震實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：HC11875500BT），胎牛血清（素爾生物科技有限公司，貨號(hào)：16000-044），溴乙啶和尿苷和丙酮酸鈉（浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，貨號(hào)分別為E406-15ML，0975-25G和0342-100G），AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，貨號(hào)：40302-ES60），寡霉素（oligomycin，OLI）（上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：1404-19-9），羰基氰對(duì)三氟甲氧基苯腙（carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl hydrazone，F(xiàn)CCP）（湖北巨勝科技有限公司，貨號(hào)：370-86-5），抗霉素A和魚藤酮組合物（antimycin A and rotenone combination，A&R）（上海晶康生物工程有限公司，貨號(hào)：G62766-25g），CellTiter-Glo發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：G7570），線粒體復(fù)合物Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ和Ⅴ活性測(cè)定試劑盒（美國(guó)Cayman Chemical公司，貨號(hào)：700930、700940、700990、701000），小鼠抗人胱天蛋白酶3、Bax、Bcl-2單克隆一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠單克隆二抗（碧云天生物科技有限公司，貨號(hào)：AC033、AB026、AB112、A0192），小鼠抗人NF-κB抑制蛋白激酶α/β（NF-κB inhibits protein kinase α/β，IKKα/β）單克隆一抗、小鼠抗人磷酸化 IKKα/β（phosphorylated IKKα/β，p-IKKα/β）單克隆一抗、小鼠抗人NF-κB 抑制因子α（NF-κB inhibitor α，IκBα）單克隆一抗、小鼠抗人p-IκBα單克隆一抗、小鼠抗人P65單克隆一抗、小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（上海Abcam公司，貨號(hào)：ab178870、ab194528、ab32518、ab1-33462、ab16502、ab9484），Pan T細(xì)胞分離試劑盒（上海科敏生物科技有限公司，貨號(hào)：DEX-130-096-535）。流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），Multiskan GO型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司），F(xiàn)luorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Proteinsimple公司），Seahorse XF24細(xì)胞代謝分析儀（上海諾能生物科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞

淋巴瘤細(xì)胞Jurkat細(xì)胞購(gòu)買于美國(guó)ATCC；T淋巴瘤細(xì)胞和正常T細(xì)胞從我院淋巴瘤患者和志愿者外周血通過Pan T細(xì)胞分離試劑盒分離。根據(jù)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)的方案，獲得所有患者的書面知情同意書。

1.3 線粒體DNA缺陷Jurkat p0細(xì)胞構(gòu)建

根據(jù)HASHIGUCHI等［10］描述的方法建立了線粒體DNA缺失的Jurkat p0細(xì)胞。Jurkat細(xì)胞在含有10%胎牛血清、溴乙啶2 mg·L-1，L-谷氨酰胺4 mmol·L-1，尿苷50 mg·L-1和丙酮酸鈉100 mg·L-1的RPMI1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)50 d。提取DNA，經(jīng)過PCR擴(kuò)增線粒體DNA上的細(xì)胞色素c氧化酶Ⅱ亞基片段（405 bp），無目的條帶說明線粒體DNA缺陷，Jurkat p0細(xì)胞構(gòu)建成功。然后保持在上述無溴乙啶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

正常T淋巴細(xì)胞、T淋巴瘤細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞和Jurkat p0細(xì)胞在含有L-谷氨酰胺4 mmol·L-1和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中在37℃培養(yǎng)。正常T淋巴細(xì)胞、T淋巴瘤細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞均用BBR 0，10，20和40 μmol·L-1處理24 h，Dox 40 μmol·L-1為陽性對(duì)照；Jurkat p0細(xì)胞用BBR 0和40 μmol·L-1處理24 h。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

離心收集1.4分組處理細(xì)胞，并按1×109L-1的密度重懸。細(xì)胞懸液中加入5 mL Annexin-Ⅴ-FITC和5 mL PI，避光孵育15 min，然后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率（%）=早期細(xì)胞凋亡率（%）+晚期細(xì)胞凋亡率（%）。

1.6 Seahorse XF24細(xì)胞代謝分析儀和H2DCFDA活性氧探針檢測(cè)細(xì)胞氧消耗率（oxygen consumption rate，OCR）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平

取1.4分組處理細(xì)胞，使用Seahorse XF24細(xì)胞代謝分析儀測(cè)量OCR。將個(gè)藥物處理過的5×104細(xì)胞接種到XF24孔板中，然后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至Seahorse XF24細(xì)胞代謝分析儀。在基礎(chǔ)條件下加OLI 1 g·L-1，A&R 2.5 mmol·L-1，連續(xù)測(cè)量OCR。為了測(cè)量細(xì)胞內(nèi)ROS水平，用H2DCFDA活性氧探針標(biāo)記細(xì)胞，將標(biāo)記的細(xì)胞重新懸浮在PI緩沖液中，并使用FC500和FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1.7 Cell Titer-Glo發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞ATP水平

取1.4分組處理細(xì)胞，按照Cell Titer-Glo發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒說明操作，以各實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度值與細(xì)胞對(duì)照組熒光強(qiáng)度值的比值表示ATP相對(duì)水平。

1.8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性

取1.4分組處理細(xì)胞，根據(jù)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ和Ⅴ活性測(cè)定試劑盒說明操作，以各實(shí)驗(yàn)組值吸光度值與細(xì)胞對(duì)照組吸光度值的比值表示線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ和Ⅴ相對(duì)活性。

1.9 Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和NF- κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

收集1.4分組處理細(xì)胞，加含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解后15 100×g離心10 min，收集上清。BCA試劑盒檢測(cè)上清中蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液制作蛋白樣品，每孔上樣30 μg蛋白。使用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，轉(zhuǎn)移至一抗（胱天蛋白酶3 1∶1000，Bax 1∶1000，Bcl-2 1∶500，IKKα/β 1∶1000，p-IKKα/β 1∶1000，IκBα 1∶2000、p-IκBα 1∶1000，P65 1∶1000）中，4℃ 孵育12 h，洗膜緩沖液洗3次；轉(zhuǎn)移至二抗液（1∶2000）中，室溫下孵育1 h后，洗膜緩沖液洗3次，加顯影液，于成像系統(tǒng)中曝光，使用軟件ImagePro plus6.0分析定量蛋白條，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH積分吸光度值比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0處理，圖形使用GraphPad Prism 6.0構(gòu)建的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-wilk檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)均呈正態(tài)分布，經(jīng)過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)方差齊，兩組比較使用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對(duì)正常T淋巴細(xì)胞、T淋巴瘤細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞和Jurkat p0細(xì)胞的凋亡的影響

如圖1所示，在正常T淋巴細(xì)胞中，與細(xì)胞對(duì)照組相比，BBR各組細(xì)胞凋亡率無明顯變化，而Dox 40 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；在T淋巴瘤細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞中，與細(xì)胞對(duì)照組相比，BBR 10 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率無明顯變化，BBR 20 μmol·L-1組凋亡率有所上升（P＜0.05），BBR 40 μmol·L-1組和Dox 40 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；在線粒體DNA缺陷Jurkat p0細(xì)胞中，BBR 40 μmol·L-1不能有效增加細(xì)胞的凋亡率。說明BBR通過破壞線粒體功能選擇性誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞的凋亡。

Fig.1 Effect of berberine（BBR）on apoptosis of normal T lymphocytes（A1，A2），T lymphoma cells（B1，B2），Jurkat cells（C1，C2）and mitochondrial DNA deletion Jurkat p0 cells（D1，D2）by flow cytometry.Jurkat p0 cells were constructed using the method described by Hashiguchi et al［10］.A2，B2，C2 and D2 were the semi-quantitative results of A1，B1，C1 and D1，respectively.Normal T lymphocytes，T lymphoma cells and Jurkat cells were treated with BBR 0，10，20，40 μmol·L-1or doxorubicin（Dox） 40 μmol·L-1（positive control）for 24 h.Jurkat p0 cells were treated with BBR 0 or 40 μmol·L-1for 24 h.±s，n=15.＊P＜ 0.05，＊＊P＜0.01，compared with the corresponding cell control group.

2.2 小檗堿對(duì)淋巴瘤Jurkat和Jurkat p0細(xì)胞線粒體呼吸的影響

如圖2所示，在淋巴瘤Jurkat細(xì)胞中，與細(xì)胞對(duì)照組相比，BBR 10 μmol·L-1組和Dox 40 μmol·L-1組OCR和ROS水平均無明顯變化，BBR 20 μmol·L-1組OCR有所降低、ROS水平有所上調(diào)（P＜0.05），BBR 40 μmol·L-1組OCR明顯降低、ROS水平明顯上調(diào)（P＜0.01）；在線粒體DNA缺陷Jurkat p0細(xì)胞中，BBR 40 μmol·L-1并不影響OCR和ROS水平；說明BBR抑制Jurkat細(xì)胞線粒體呼吸。

2.3 小檗堿對(duì)淋巴瘤Jurkat和Jurkat p0細(xì)胞ATP水平的影響

如表1所示，在淋巴瘤Jurkat細(xì)胞中，與細(xì)胞對(duì)照組相比，BBR 10 μmol·L-1組和Dox 40 μmol·L-1組ATP水平均無明顯變化，BBR 20 μmol·L-1組ATP水平有所下調(diào)（P＜0.05），BBR 40 μmol·L-1組ATP水平明顯下調(diào)（P＜0.01）；在線粒體DNA缺陷Jurkat p0細(xì)胞中，BBR 40 μmol·L-1并不影響ATP水平；說明BBR通過抑制Jurkat細(xì)胞線粒體呼吸來抑制ATP水平。

2.4 小檗堿對(duì)Jurkat和Jurkat p0細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性的影響

如圖3所示，在淋巴瘤Jurkat細(xì)胞中，與細(xì)胞對(duì)照組相比，BBR 10 μmol·L-1組和Dox 40 μmol·L-1組線粒體呼吸鏈復(fù)合物均無明顯變化，BBR 20 μmol·L-1組線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性有所降低（P＜0.05），Ⅱ，Ⅳ或Ⅴ活性無明顯變化，BBR 40 μmol·L-1組線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性明顯降低（P＜0.01），Ⅱ，Ⅳ或Ⅴ活性無明顯變化；在線粒體DNA缺陷Jurkat p0細(xì)胞中，BBR 40 μmol·L-1并不影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性；說明BBR通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的活性來抑制Jurkat細(xì)胞線粒體呼吸。

Tab.1 Effect of BBR on ATP levels of Jurkat cells and Jurkat p0 cells

2.5 小檗堿對(duì)正常T淋巴細(xì)胞、T淋巴瘤細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞凋亡及NF- κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig.2 Effect of BBR on oxygen consumption rate（OCR）and reactive oxygen species（ROS）levels in Jurkat cells（A1，A2，A3，B）and Jurkat p0 cells（C1，C2，C3，D）by Seahorse XF24 Cell Metabolism Analyzer.See Fig.1 for the cell treatment.A2，A3，C2，C3 were the quantities of A1 and C1，respectively.±s，n=9.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the corresponding cell control group.

Fig.3 Effect of BBR on mitochondrial respiratory complex activity in lymphoma Jurkat（A）and Jurkat p0（B）cells.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=9.＊P＜0.05，＊＊P ＜0.01，compared with cell control group.

Fig.4 Effect of BBR on normal T lymphocytes（A1，A2），T lymphoma cells（B1，B2），and Jurkat cells（C1，C2，D1，D2）apoptosis and expression of NF- κB pathway related proteins by Western blotting.A2，B2，C2 and D2 were the semi-quantitative results of A1，B1，C1 and D1，respectively.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=9.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

如圖4所示，在正常T淋巴細(xì)胞中，與細(xì)胞對(duì)照組相比，BBR各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白無明顯變化，而Dox 40 μmol·L-1組活化的胱天蛋白酶3和Bax蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；在T淋巴瘤細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞中，與細(xì)胞對(duì)照組相比，BBR 10 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)無明顯變化，BBR 20 μmol·L-1組活化胱天蛋白酶3和Bax蛋白表達(dá)有所上調(diào)（P＜0.05）、Bcl-2蛋白表達(dá)有所下調(diào)（P＜0.05），BBR 40 μmol·L-1組和Dox 40 μmol·L-1組活化的胱天蛋白酶3和Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01）。在淋巴瘤Jurkat細(xì)胞中，與細(xì)胞對(duì)照組相比，BBR 10 μmol·L-1組和 Dox 40 μmol·L-1組NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)均無明顯變化，BBR 20 μmol·L-1組 NF-κB 通路相關(guān)蛋白 p-IKKα/β/IKKα/β、p-IκBα/IκBα和核內(nèi)P65表達(dá)有所下調(diào)（P＜0.05），BBR 40 μmol·L-1組 NF-κB 通路相關(guān)蛋白p-IKKα/β/IKKα/β、p-IκBα/IκBα和核內(nèi)P65表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01）；說明BBR抑制Jurkat細(xì)胞NF-κB通路激活。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，BBR增加了淋巴瘤患者的T細(xì)胞凋亡率，并上調(diào)了淋巴瘤患者的T細(xì)胞中凋亡蛋白活化胱天蛋白酶3和Bax的表達(dá)，下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，但對(duì)正常T淋巴細(xì)胞的凋亡并無影響。這說明BBR選擇性地誘導(dǎo)患者的T淋巴瘤細(xì)胞凋亡，而不影響T淋巴細(xì)胞的存活。這可能與血液癌癥獨(dú)特的靶向氧化磷酸化的代謝依賴性有關(guān)［12］。與T淋巴細(xì)胞相比，T淋巴瘤細(xì)胞更多地依賴線粒體呼吸鏈的有氧代謝而不是糖酵解來滿足能量需求并維持生存［13］。抑制氧化磷酸化對(duì)T淋巴瘤細(xì)胞具有選擇性毒性，但對(duì)正常T淋巴細(xì)胞無作用［14］。提示BBR選擇性地誘導(dǎo)淋巴瘤患者的T細(xì)胞凋亡與線粒體呼吸功能損傷有關(guān)。

為了更好地研究BBR選擇性誘導(dǎo)淋巴瘤凋亡的機(jī)制，選取常用的淋巴瘤Jurkat細(xì)胞為研究對(duì)象，同樣發(fā)現(xiàn)BBR選擇性誘導(dǎo)淋巴瘤Jurkat細(xì)胞凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)，BBR處理的Jurkat細(xì)胞的OCR呈濃度依賴性降低，且BBR通過抑制Jurkat細(xì)胞中的呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性來抑制線粒體呼吸。而在線粒體呼吸鏈缺乏的Jurkat p0細(xì)胞中，BBR對(duì)細(xì)胞凋亡并無誘導(dǎo)作用。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了BBR通過抑制線粒體呼吸作用于T細(xì)胞淋巴瘤。BBR在Jurkat細(xì)胞中抑制線粒體呼吸會(huì)造成ROS升高和ATP水平降低。氧化還原穩(wěn)態(tài)維持對(duì)于T淋巴瘤細(xì)胞的生存至關(guān)重要［15］。ROS的輕微升高，特別是由呼吸鏈抑制產(chǎn)生的ROS會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞死亡，并促進(jìn)了基因組的不穩(wěn)定性［16］。與正常T淋巴細(xì)胞相比，在T淋巴瘤細(xì)胞中需要更高的ATP水平，這表明淋巴瘤T細(xì)胞具有更高的代謝活性，更多地依賴線粒體呼吸來存活［17］。

NF-κB在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用，該轉(zhuǎn)錄因子除了影響癌細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)移和炎癥外，還在控制能量穩(wěn)態(tài)和介導(dǎo)癌癥代謝重編程中起關(guān)鍵作用［18］。線粒體是癌癥改變的許多新陳代謝過程的核心參與者，控制著除生物能量學(xué)以外的包括生物合成代謝，氧化還原穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種基本細(xì)胞功能。有研究表明，NF-κB可以影響線粒體呼吸和線粒體動(dòng)力學(xué)，同時(shí)，線粒體可以感知壓力信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換為導(dǎo)致NF-κB活化的細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)，BBR可下調(diào)淋巴瘤Jurkat細(xì)胞中 NF-κB 通路相關(guān)蛋白 p-IKKα/β/IKKα/β、p-IκBα/IκBα和核內(nèi)P65表達(dá)，說明BBR對(duì)淋巴瘤Jurkat細(xì)胞通過破壞線粒體功能的選擇性誘導(dǎo)作用與NF-κB通路抑制有關(guān)。

綜上，BBR通過破壞線粒體功能選擇性誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞的凋亡，這可能與NF-κB通路抑制有關(guān)，為BBR的開發(fā)利用提供新思路，為淋巴瘤的治療奠定基礎(chǔ)。