復(fù)方益肝顆粒中活性成分的提取工藝研究

陳東紅,黃阿賢

(1.福建省藥械聯(lián)合采購(gòu)中心,福建 福州 350001；2.福建漳州美利得生物工程公司,福建 漳州 363600)

復(fù)方益肝顆粒系漳州美利得生物工程公司擬在原南靖縣中醫(yī)院用于治療慢性乙肝老驗(yàn)方的基礎(chǔ)上研發(fā)的中藥新制劑。驗(yàn)方是由原福建省名老中醫(yī)肖子精主任提供的，由苦參(君藥)、虎杖、茵陳、白笈、田雞黃等數(shù)味中草藥組成的復(fù)方制劑(原為水煎劑)。其作為醫(yī)院制劑用于治療慢性乙肝50余年，臨床上取得較好療效。本實(shí)驗(yàn)是在原處方加以改良，并通過(guò)正交試驗(yàn)確立提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀 器

薄層色譜儀(上?？普苌萍脊?;AB-8型大孔吸附樹(shù)脂(天津波鴻樹(shù)脂科技有限公司);高效硅膠G板100 mm×200 mm(青島基億達(dá)公司)。

1.2 試藥與試劑

復(fù)方益肝顆粒(漳州美利得生物工程公司,190926);苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);苦參、虎杖、茵陳等藥材(漳州藥材站)。試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層掃描法測(cè)定苦參堿

2.1.1苦參藥材供試液的制備

稱取苦參藥材粗粉約1.0 g，置具塞錐形瓶中，加氯仿25 mL、濃氨試液0.5 mL，按文獻(xiàn)方法制備，定容到5 mL即得[1-3]。

2.1.2復(fù)方益肝膠囊供試品溶液的制備

稱取復(fù)方益肝顆粒內(nèi)容物1.0 g,置有塞錐形瓶中，加氯仿15 mL，濃氨試液0.5 mL，按文獻(xiàn)方法制備，定容到2 mL即得[1-3]。

2.1.3陰性對(duì)照液的制備

取除苦參以外的所有藥材，按照樣品供試液的制備方法制備陰性對(duì)照液。

2.1.4對(duì)照品溶液的制備

精密稱取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品2.2 mg，加無(wú)水乙醇定容于1 mL容量瓶中，制成1.1 g/L對(duì)照品溶液。

2.1.5對(duì)照品溶液的制備

薄層色譜條件及掃描條件高效硅膠G板100 mm×200 mm，點(diǎn)樣后氨熏15 min；異辛烷-丙酮-醋酸乙酯-氨水(4.5∶4.5∶6∶0.3)為展開(kāi)劑，氨預(yù)飽和15 min，稀碘化鉍鉀試液顯色，λs=480 nm，λR=650 nm,雙波長(zhǎng)反射式鋸齒掃描。

2.1.6線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,依法展開(kāi),顯色,掃描測(cè)定。以點(diǎn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為γ=-23 899.6+72 406.3X(r=0.9989，n=5)。苦參堿在1.17～5.83 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.7對(duì)照品溶液的制備

測(cè)定方法精密吸取對(duì)照品溶液1 μL和2 μL,苦參藥材供試液2 μL，復(fù)方益肝顆粒供試液和陰性對(duì)照液各1.5 μL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下點(diǎn)樣，展開(kāi)，掃描，Rf=0.65，用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。

2.1.8回收率試驗(yàn)

精密吸取已知含量的樣品3次，分別加入對(duì)照品適量，點(diǎn)樣展開(kāi)，掃描測(cè)定。結(jié)果平均回收率98.81%，RSD1.95%，實(shí)驗(yàn)表明回收率良好。

2.1.9精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液1 μL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法重復(fù)點(diǎn)樣5次，展開(kāi)，掃描，峰面積的RSD=1.37%。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1因素水平表的研究

參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在各提取條件中，水用量﹑提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)提取的浸膏得率有一定影響。在水平分布的選擇時(shí)，中間水平實(shí)驗(yàn)的浸膏得率(9倍量水提取2次，每次2 h)在每一組中均超過(guò)了85%，同時(shí)考察提取條件對(duì)苦參堿指標(biāo)成分的影響概況，故按表1進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。

按處方比例取各藥材(水浸泡30 min),按正交試驗(yàn)條件加水加熱提取數(shù)次,濾過(guò),合并濾液,定容于50 mL容量瓶中備用。

表 1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.2.2苦參正交試驗(yàn)樣品測(cè)定

量取正交提取液各5 mL于分液漏斗中，加入濃氨水2 mL，參照文獻(xiàn)方法制備供試品液[2-3]，定容為約1 mL。取供試品液2 μL照上述測(cè)定方法測(cè)定。正交試驗(yàn)分析表見(jiàn)表2。方差分析表明，各因素對(duì)苦參堿提取含量無(wú)顯著性影響。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)苦參藥材水提物中既含有苦參堿，也含有氧化苦參堿，但在本復(fù)方制劑中無(wú)法檢測(cè)到氧化苦參堿(圖1,色譜條件：高效硅膠G板10 cm×20 cm，點(diǎn)樣后氨熏15 min；展開(kāi)劑為氯仿-甲醇-氨水=8∶1∶0.2，稀碘化鉍鉀試液顯色)；提示可能有氧化苦參堿逐漸向苦參堿轉(zhuǎn)化。

表 2 L9(34)苦參堿正交試驗(yàn)分析表

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)選擇苦參堿為復(fù)方益肝顆粒劑中君藥苦參含量測(cè)定的指標(biāo)成分之一，可作為輔助控制該劑型的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。薄層掃描檢測(cè)苦參堿時(shí)發(fā)現(xiàn)，在苦參堿對(duì)照品相應(yīng)位置，后者的斑點(diǎn)較大，說(shuō)明后者提取效率更高，故采用第二種提取方法[2-3]。

1.苦參藥材,2.復(fù)方益肝顆粒,3.樣品,4.氧化苦參堿

由于苦參堿中含有多種生物堿,在薄層色譜中分離較為困難。本實(shí)驗(yàn)采用氯仿-甲醇-氨水、環(huán)己烷-氯仿-甲醇-氨水、環(huán)己烷-氯仿-丙酮-甲醇-氨水、異辛烷-丙酮-醋酸乙酯-氨水等多種展開(kāi)劑，結(jié)果表明,以異辛烷-丙酮-醋酸乙酯-氨水為展開(kāi)劑,可使苦參堿與其他,堿類成分分離完好,斑點(diǎn)清晰。本法可為復(fù)方中藥制劑中苦參堿測(cè)定提供參考[4-6]。

正交試驗(yàn)表明水用量、提取時(shí)間及次數(shù)3個(gè)因素對(duì)本處方中苦參堿含量均無(wú)顯著影響,因此其最佳工藝將根據(jù)配方中另一指標(biāo)成分虎杖苷含量的測(cè)定結(jié)果再確定。