蝦青素法夫酵母β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶的生物信息學分析

張爽 許勇 童琳

摘要：以蝦青素中法夫酵母酶氨基酸序列為研究對象，利用ProtParam、SignalP、PSORT、ProtScale、SOMPA、PredictProtein、PROSITE、COILS和SWISS-MODEL等在線預測工具，對其理化性質(zhì)、亞細胞定位、親疏水性、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)等進行分析。結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)化酶由557個氨基酸殘基構(gòu)成，是一種無信號肽，具有跨膜結(jié)構(gòu)，定位于細胞色素氧化酶中的可溶性親水蛋白。α螺旋和無規(guī)卷曲為主要的二級結(jié)構(gòu)元件。三級結(jié)構(gòu)以PDB ID 5vcc.1的B鏈為模板，功能預測為細胞色素P450。生物信息學手段分析預測結(jié)果可靠性較高，為進一步研究蝦青素的生物合成調(diào)控機制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蝦青素;法夫酵母;β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶;生物信息學

中圖分類號：S963.73 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）01-0156-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.036 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： The amino acid sequence of the yeast extract of Astaxanthin was used as the research object. The physical and chemical properties and subcellular localization were determined by online prediction tools such as ProtParam， SignalP， PSORT， ProtScale， SOMPA， PredictProtein， PROSITE， COILS and SWISS-MODEL.， pro-hydrophobicity， secondary structure， tertiary structure， etc. were analyzed. The invertase consisted of 557 amino acid residues and was a signal-free peptide， a transmembrane structure， and a soluble hydrophilic protein localized in cytochrome oxidase. The alpha helix and random coil are the primary secondary structural elements. The tertiary structure uses the B-chain of PDB ID 5vcc.1 as a template， and its function is predicted to be cytochrome P450. The bioinformatics method is more reliable in analyzing and predicting the results， which lays a theoretical foundation for further research on the biosynthesis regulation mechanism of astaxanthin.

Key words： astaxanthin; phaffia rhodozyma; β-carotene converting enzyme; bioinformatics

蝦青素（Astaxanthin）是一種抗氧化性極強的天然類胡蘿卜素，具有著色、抗腫瘤、增強免疫力等多種生物學功能，被廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、醫(yī)藥、保健食品等行業(yè)中[1]。法夫酵母（Phaffia rhodozyma）是一種重要的天然蝦青素資源，其體內(nèi)的β-胡蘿卜素（β-carotene）轉(zhuǎn)化酶（Asy）是目前發(fā)現(xiàn)的惟一一個直接參與氧化β-胡蘿卜素成為蝦青素的酶[2]。在法夫酵母中，乙酰輔酶A經(jīng)過甲羥戊酸途徑轉(zhuǎn)變?yōu)楫愇煜┙沽姿幔↖sopentenyl pyrophosphate，IPP），然后通過異構(gòu)、縮合、脫氫、環(huán)化等步驟合成β-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素經(jīng)羥化和酮化作用后形成蝦青素[3]。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

蝦青素法夫酵母β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列下載自NCBI網(wǎng)站，GenBank登錄號為DQ002007.1。

1.2 ?生物信息學分析

利用 ProtParam 分析蝦青素法夫酵母β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶的理化性質(zhì)，SignalP[4]預測信號肽，PSORT預測細胞亞定位，TMHMM進行跨膜結(jié)構(gòu)分析，ProtScale預測親疏水性[5]，SOMPA預測二級結(jié)構(gòu)[6]，PredictProtein[7]預測二硫鍵，PROSITE預測功能位點，COILS[8]預測卷曲螺旋，SWISS-MODEL[9-11]進行同源建模。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?Asy的一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

ProtParam分析結(jié)果顯示，Asy由557個氨基酸殘基組成（表1），其中比例最高的為Leu（L），占9.9%;比例最低的為Cys（C），占0.5%。Asy的相對分子質(zhì)量為62630.88，理論等電點（pI）為5.67，其中帶負電氨基酸殘基Asp（D）和Glu（E）的總數(shù)為77個，帶正電氨基酸殘基Arg（R）和Lys（K）的總數(shù)為67個，半衰期大于30 h，不穩(wěn)定系數(shù)41.77，脂肪族指數(shù)88.98，總平均親水性GRAVY為-0.195，為穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。

2.2 ?Asy的信號肽、亞細胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域和親疏水性分析

通過SignalP 4.1 Server分析發(fā)現(xiàn)，Asy的自然分裂位點分值（C-Score）的峰值為0.130 7（第20位），組合分裂位點分值（Y-Score）的峰值為0.284（第20位），組合分裂位點分值（S-Score）的峰值為0.809（第1位），并不存在信號肽（圖1）。TargetP 1.1 Server-prediction results預測Asy在細胞內(nèi)的定位，mTP為 0.190，SP為0.855，RC為2，說明該蛋白主要分布于細胞質(zhì)內(nèi)。

PSORT 細胞亞定位預測Asy位于細胞色素氧化酶中。應用 TMHMM Server v.2.0對Asy進行跨膜結(jié)構(gòu)分析（圖2），發(fā)現(xiàn)該蛋白含有一個跨膜結(jié)構(gòu)域（TMHs），非跨膜螺旋區(qū)（ExpAA）為22.831 27 ?（>18），預測表明該蛋白為跨膜蛋白;蛋白的N端位于膜內(nèi)側(cè)的概率為0.980 63，說明該蛋白總體位于膜內(nèi)。通過ProtScale對Asy的氨基酸序列親疏水性進行在線預測，多肽鏈中的第7位L的疏水值為2.733，是疏水性最強的氨基酸，第130位K疏水值為-2.878，是親水性最強的氨基酸。整條肽鏈中親水性氨基酸殘基數(shù)多于疏水性氨基酸殘基（圖3），可以預測Asy為可溶性親水蛋白。

2.3 ?Asy的二級結(jié)構(gòu)分析

利用SOMPA對Asy的二級結(jié)構(gòu)進行分析預測，發(fā)現(xiàn)其二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋占45.42%（253個氨基酸殘基），延伸鏈結(jié)構(gòu)占12.03%（67個氨基酸殘基），β轉(zhuǎn)角占3.59%（20個氨基酸殘基），無規(guī)卷曲占38.96%（217個氨基酸殘基），可以看出α螺旋和無規(guī)卷曲是Asy二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成原件。

PredictProtein預測結(jié)果表明，Asy中不存在二硫鍵;PROSITE蛋白質(zhì)功能位點分析發(fā)現(xiàn)，Asy具有G蛋白偶聯(lián)受體家族1的特征（438-454aa），其氨基酸序列為GTMVMLPLFNINRSKFI。

2.4 ?Asy的卷曲螺旋域分析

如圖4所示，通過COILS分析，Asy在Window=7、14、21時，卷曲概率均小于0.5，說明Asy不含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

2.5 ?Asy的三級結(jié)構(gòu)建模及結(jié)合位點預測

SWISS-MODEL建模以PDB ID 5vcc.1的B鏈為模板，功能預測為細胞色素p450。模型的總體評價為0.57，Qmean為-3.68（圖5）。

3 ?討論

β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶（Asy）是法夫酵母β-胡蘿卜素到蝦青素轉(zhuǎn)化過程中發(fā)現(xiàn)的惟一一個酶，但是目前國內(nèi)外對于該酶的研究甚少，其在法夫酵母中的功能、催化機理及其酶學性質(zhì)等方面都缺乏深入的研究[12]。從生物信息學分析的結(jié)果可以看出，Asy整條肽鏈中親水性氨基酸殘基數(shù)多于疏水性氨基酸殘基，并且其二級結(jié)構(gòu)中富含α螺旋和無規(guī)卷曲，有助于保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。Asy是穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。Asy中不含二硫鍵，這可能是由于其Cys殘基含量低并且在催化功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)主要與分子識別、細胞骨架和細胞運動等功能相關(guān)，Asy中不含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，也不發(fā)揮上述功能。

研究發(fā)現(xiàn)，Asy是以膜蛋白的形式少量存在于法夫酵母中，Asy同時具備羥化和酮化的功能。從結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn)Asy的438-454aa區(qū)域具有G蛋白耦聯(lián)受體家族1的特征，G蛋白耦聯(lián)受體A類為視紫紅質(zhì)樣受體，視紫紅質(zhì)是一種由視黃醛和視蛋白結(jié)合而成的結(jié)合蛋白。通過生物信息學手段對Asy的分析預測結(jié)果顯示與其實際功能有很強的聯(lián)系，證明預測結(jié)果的可靠性較高。這對于研究法夫酵母β-胡蘿卜素到蝦青素的轉(zhuǎn)化過程提供了新的思路。

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