劉光鵬，初樂，朱風(fēng)濤，張鑫，孫苗苗，高玲，趙巖*

（1.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南 250014；2.綠杰股份有限公司，山東龍口 265718）

我國的蘋果種植面積和產(chǎn)量均高居世界首位，但蘋果的加工總量不足產(chǎn)量的20%，且加工形式以果汁加工為主[1]。蘋果醋是以蘋果汁為原料經(jīng)微生物發(fā)酵而成的一種健康飲品，含有多種對人體有益的營養(yǎng)和功能成分，具備水果和食醋的雙重保健功效[2-4]，而且蘋果醋還可以作為調(diào)味品使用。我國目前市場上蘋果醋產(chǎn)品大多以蘋果濃縮汁為原料，更有甚者采用食醋、醋精、甜味劑和食用香料調(diào)配而成，而采用蘋果鮮汁發(fā)酵的較少。隨著人們對蘋果醋產(chǎn)品保健效果的認知，以蘋果鮮汁為原料釀造的蘋果醋市場前景廣闊[5-6]，蘋果醋發(fā)酵技術(shù)也已成為蘋果精深加工重點開展的研究方向之一。近年來對蘋果醋發(fā)酵工藝和技術(shù)的研究較多，但大多集中在菌種選育、實驗室搖床工藝優(yōu)化及分析上[7-12]，只有少量利用醋酸專用發(fā)酵罐（自吸式發(fā)酵罐）進行食醋發(fā)酵的研究報道[13]，而蘋果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化研究則鮮見報道。鑒于此，本試驗對蘋果醋發(fā)酵工藝進行了分析，并采用響應(yīng)面法對蘋果醋發(fā)酵過程的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌轉(zhuǎn)速和接種量4 個因素的最佳工藝參數(shù)進行了探討，旨在為蘋果醋的工業(yè)生產(chǎn)提供可靠的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗材料

（1）菌種：釀酒酵母CTCF0001（Saccharomyces cerevisiae CTCF0001），醋酸菌 CTCF0001（Acetobacter aceti CTCF0001），以上兩株菌均來自中華全國供銷合作總社濟南果品研究院發(fā)酵技術(shù)研究室。

（2）原料：煙臺紅富士蘋果，綠杰股份有限公司；果膠酶，NOVOZYMES 公司。

（3）試劑：磷酸二氫鉀、硫酸鎂、鹽酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、五水合硫酸銅、碳酸鈣、磷酸二氫鉀、葡萄糖、硫酸鎂等，均為分析純；酵母膏、瓊脂粉、食用酒精。

（4）培養(yǎng)基：液體種子培養(yǎng)基（葡萄糖1%、酵母膏1.5%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.05%，于121 ℃滅菌20 min，冷卻后添加3%的酒精）；二級種子培養(yǎng)基：將經(jīng)酵母發(fā)酵的蘋果酒稀釋至酒精度為3%～4%作為二級種子培養(yǎng)基。

1.1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，HH-4 型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；全自動立式壓力蒸汽滅菌器，YXQ-LS-100A 型，上海博迅實業(yè)有限公司；智能型垂直流超凈工作臺，SW-CJ-2FD 型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；全溫度恒溫調(diào)速搖床柜，ZWYR-2112B 型，上海智誠分析儀器制造有限公司；數(shù)碼生物顯微鏡，BA310C，Motic 麥克迪奧實業(yè)集團有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘋果醋發(fā)酵工藝流程

蘋果→破碎→榨汁→一次殺菌→接種酵母菌（添加酶制劑）→酒精發(fā)酵→二次殺菌→接種醋酸菌→醋酸發(fā)酵→除渣→陳釀→過濾→三次殺菌→成品

1.2.2 操作要點

（1）酒精發(fā)酵

無菌條件下在發(fā)酵料液中接入適量的酵母菌，發(fā)酵初期可通入適量的空氣，以利于酵母菌的迅速繁殖和酒精發(fā)酵，控制合適的發(fā)酵溫度。當(dāng)發(fā)酵液中酒精度在6.5%（v/v）以上、殘還原糖含量在0.5%～0.6%時，即可認為酒精發(fā)酵結(jié)束，測定并記錄發(fā)酵液的酒精度。

（2）醋酸菌的培養(yǎng)

一級種子培養(yǎng)：取一環(huán)活化后的醋酸菌種接入裝有10 mL 液體種子培養(yǎng)基的試管中，在旋轉(zhuǎn)式恒溫搖床上于33 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h。

二級種子培養(yǎng)：以1%（v/v）的接種量將培養(yǎng)24 h 后的一級種子轉(zhuǎn)接至裝有300 mL 二級種子培養(yǎng)液的兩個1 000 mL 搖瓶中，在旋轉(zhuǎn)式恒溫搖床上于33 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

（3）醋酸發(fā)酵

在酒精發(fā)酵醪液中接入醋酸菌二級種子液，控制合適的溫度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間等工藝參數(shù)，同時定時取樣測定發(fā)酵液中的總酸，當(dāng)總酸不再增加時，醋酸發(fā)酵結(jié)束。

1.2.3 醋酸發(fā)酵優(yōu)化試驗設(shè)計

（1）單因素試驗

選擇發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時間36 h、醋酸菌接種量8%、攪拌速率1 400 r/min 為因素，以發(fā)酵醪液中的總酸含量（即酒精的轉(zhuǎn)化率）為考察指標(biāo)，每次變化一個因素水平進行不同發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、醋酸菌接種量和攪拌速率四項單因素試驗。

（2）響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素的基礎(chǔ)上，以醪液中總酸含量為考察指標(biāo)，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、醋酸菌接種量和攪拌速率4 個因素為自變量，再用Design Expert 8.0 軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化，分析蘋果醋發(fā)酵的最佳條件。

1.3 測定指標(biāo)與方法

總酸：酸堿滴定法測定，參照GB/T12456-2008。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Microsoft Excel 和Design Expert 8.0 軟件統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)，并對實驗數(shù)據(jù)所得響應(yīng)面模型進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果醋發(fā)酵的單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵溫度對蘋果醋總酸含量的影響

在蘋果醋發(fā)酵時間48 h、醋酸菌接種量8%、攪拌轉(zhuǎn)速1 400 r/min 的條件下，設(shè)定醋酸菌的發(fā)酵溫度分別為27、30、33、36、39 ℃時，考察蘋果醋發(fā)酵溫度對總酸生成量的影響，試驗結(jié)果見圖1。

數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)結(jié)構(gòu)包括將數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)與數(shù)據(jù)庫/數(shù)據(jù)倉庫系統(tǒng)耦合的各種考慮。有多重可能的設(shè)計:不耦合、松散耦合、半緊密耦合和緊密耦合。一個良好的設(shè)計的數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)與數(shù)據(jù)庫和/或數(shù)據(jù)倉庫的緊密或半緊密耦合。這里所謂的“耦合(Coupling，結(jié)合，連結(jié))”實際上就是要求多邊矩陣剖面廣義交叉乘積的運算方法應(yīng)保證運算結(jié)果矩陣的階數(shù)不高，數(shù)據(jù)信息比較集中。

圖1 顯示了發(fā)酵溫度對醋酸菌的產(chǎn)酸速率具有顯著影響。發(fā)酵溫度過低，發(fā)酵緩慢、產(chǎn)酸速率低；發(fā)酵溫度過高則導(dǎo)致酒精和醋酸菌的揮發(fā)加快，醋酸會氧化為二氧化碳和水，醋酸菌老化提前，使醋酸發(fā)酵效率變低。由圖1 可知，在發(fā)酵溫度為27 ℃和30 ℃時，醋酸菌產(chǎn)酸速度慢、時間長，最終發(fā)酵醪液中的總酸含量低。在發(fā)酵溫度為33 ℃和36 ℃時，產(chǎn)酸量高，其中33 ℃終發(fā)酵醪液的總酸含量最高，發(fā)酵時間只需36 h。當(dāng)發(fā)酵溫度為39 ℃時，過高的發(fā)酵溫度導(dǎo)致菌種提前老化，即使有較短的發(fā)酵周期，但是產(chǎn)酸量低。由試驗結(jié)果得知，醋酸發(fā)酵的最佳溫度為33 ℃。

2.1.2 發(fā)酵時間對蘋果醋總酸含量的影響

在蘋果醋發(fā)酵溫度33 ℃、醋酸菌接種量8%、攪拌轉(zhuǎn)速1 400 r/min 的條件下，設(shè)定醋酸菌的發(fā)酵時間分別為24、30、36、42、48 h 時，考察蘋果醋發(fā)酵時間對總酸含量的影響，試驗結(jié)果見圖2。

醋酸菌發(fā)酵分為三個階段。發(fā)酵前期是醋酸菌種適應(yīng)期，菌種生長緩慢、產(chǎn)酸量少，發(fā)酵醪液酸度低；中期為醋酸菌的對數(shù)生長期，產(chǎn)酸速率加快，總酸快速增長；后期開始為醋酸菌氧化酶大量分泌，催化乙醇與空氣中的氧結(jié)合形成乙酸，但氧化反應(yīng)逐漸變緩，酸度趨于穩(wěn)定，發(fā)酵時間繼續(xù)延長，醪液中的醋酸含量反而緩慢下降。由圖2 可知，發(fā)酵時間24～30 h 是蘋果醋的總酸快速增加期，發(fā)酵時間在30～36 h 時，發(fā)酵液中的總酸繼續(xù)增加，但總酸增加速率放緩，發(fā)酵36 h 時，蘋果醋中的總酸達到最大值；發(fā)酵后期，醋酸菌活力減弱，酸度趨于穩(wěn)定。若繼續(xù)延長發(fā)酵時間，醋酸含量反而會下降，分析其原因，可能是因為耗氧發(fā)酵帶走的醋酸產(chǎn)生量小于少量殘余酒精轉(zhuǎn)化成醋酸的量以及醋酸被轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水的量。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇醋酸發(fā)酵的最佳時間是36 h。

2.1.3 醋酸菌接種量對蘋果醋總酸含量的影響

在蘋果醋發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時間48 h、攪拌轉(zhuǎn)速1 400 r/min 的條件下，設(shè)定醋酸菌的接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%時，考察醋酸菌的接種量對蘋果醋總酸含量的影響，試驗結(jié)果見圖3。

由圖3 可得，在其它條件一定的情況下，醋酸菌接種量為4%和6%時，發(fā)酵速率較為緩慢，產(chǎn)酸量相對較低；在醋酸菌接種量為8%和10%時，發(fā)酵醪液中的總酸變化趨勢基本一致，12～30 h 產(chǎn)酸速率較快，發(fā)酵36 h 時，以8%接種量的發(fā)酵醪液中總酸濃度最高，36 h 后發(fā)酵醪液中的總酸含量有下降的趨勢。當(dāng)接種量為12%時，短時間內(nèi)產(chǎn)酸速率最快，但最終發(fā)酵醪液中的總酸含量低于8%和10%接種量的總酸含量，分析其原因可能是因為接種量過多，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)并沒有相應(yīng)的增加，但是醋酸菌在生長繁殖時需要消耗較多的營養(yǎng)物質(zhì)，造成醋酸生成量的減少，而且較大的接種量對發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味會有不良影響[14]。結(jié)合試驗數(shù)據(jù)分析，選擇醋酸發(fā)酵的最佳接種量為8%。

2.1.4 攪拌轉(zhuǎn)速對蘋果醋發(fā)酵總酸含量的影響

在蘋果醋發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時間48 h、醋酸菌接種量8%的條件下，設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速分別為800、1 100、1 400、1 700、2 000 r/min 時，考察攪拌轉(zhuǎn)速對總酸生成量的影響，試驗結(jié)果見圖4。

由圖4 可知，攪拌轉(zhuǎn)速對蘋果醋發(fā)酵具有較大的影響。攪拌轉(zhuǎn)速和發(fā)酵液中的溶氧存在較大的相關(guān)性。在發(fā)酵前12 h，由于醋酸菌對氧的需求較少，攪拌速率對醋酸的生成影響較小；發(fā)酵12 h 后，攪拌轉(zhuǎn)速為800 r/min和1 100 r/min 時，由于發(fā)酵液中溶解氧的不足使得醋酸的生成較為緩慢，但攪拌轉(zhuǎn)速1 100 r/min 的醋酸生成速率明顯快于攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min 的醋酸生成速率；發(fā)酵速率高于1 400 r/min 時，發(fā)酵時間在0～36 h 的總酸增長曲線基本一致，但在30 h 后，以1 400 r/min 攪拌轉(zhuǎn)速醪液中的總酸含量最高。分析其原因可能因為一方面過多的溶解氧使得醋酸菌生長旺盛，耗去發(fā)酵液中大量養(yǎng)分，另一方面轉(zhuǎn)速過高使發(fā)酵液中酒精和醋酸揮發(fā)，發(fā)酵到后期轉(zhuǎn)化率不斷下降。因此，攪拌轉(zhuǎn)速選擇1 400 r/min。

2.2 蘋果醋發(fā)酵的響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，為了研究不同因素對總酸（醋酸）生成的影響，確定最優(yōu)的蘋果醋發(fā)酵工藝參數(shù)，選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌轉(zhuǎn)速、接種量作為響應(yīng)面優(yōu)化的考察因素。根據(jù)Design Expert 8.0 軟件中的Box-Behnken 設(shè)計原理，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化分析試驗，以發(fā)酵醪液中的總酸生成量為響應(yīng)值（Y），用-1、0、1來表示因素低、中、高三水平，試驗設(shè)計見表1，結(jié)果見表2。

表2 的試驗結(jié)果包括24 個取值在A、B、C、D 所構(gòu)成的三維頂點，5 個區(qū)域零點重復(fù)試驗點。對表中的試驗結(jié)果進行回歸分析，得到蘋果醋發(fā)酵過程中總酸含量對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌轉(zhuǎn)速、接種量的四元二次回歸方程：Y=60.42+1.31A+3.05B+1.84C+1.92D+0.20AB-1.92AC-1.90AD-0.025BC-0.68BD-0.48CD-2.35A2-2.83B2-1.95C2-2.46D2。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 2 Response surface experimental design and results

對所得回歸方程進行變異分析和顯著性檢驗結(jié)果如表3 所示。由表3 可以看出，模型的回歸項P＜0.013 9，表明所選擇的響應(yīng)面回歸模型顯著。失擬項P=0.997 1＞0.05，即失擬項差異不顯著，表明該二次回歸模型能夠顯著擬合發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌轉(zhuǎn)速、接種量對蘋果醋中總酸生成量的影響，該模型能夠替代試驗真實點對試驗數(shù)據(jù)進行分析。從表3 可得出四元二次回歸方程系數(shù)的顯著性，攪拌轉(zhuǎn)速（C）、接種量（D）、發(fā)酵溫度二次項（A2）、發(fā)酵時間二次項（B2）對蘋果醋發(fā)酵的總酸含量具有顯著影響；發(fā)酵時間（B）對蘋果醋發(fā)酵的總酸含量具有高度顯著影響；發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵溫度（A）和發(fā)酵時間（B）的交互項、發(fā)酵溫度（A）和攪拌轉(zhuǎn)速（C）的交互項、發(fā)酵溫度（A）和接種量（D）的交互項、發(fā)酵時間（B）和攪拌轉(zhuǎn)速（C）的交互項、發(fā)酵時間（B）和接種量（D）的交互項、攪拌轉(zhuǎn)速（C）和接種量（D）的交互項對蘋果醋發(fā)酵的總酸含量影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 響應(yīng)面模型分析討論

利用Design Expert 8.0.5b 軟件對表2 的試驗數(shù)據(jù)進行四元二次回歸擬合分析，所得響應(yīng)面圖見圖5～10。各因素及其交互作用對蘋果醋總酸生成量的影響結(jié)果可通過響應(yīng)面圖直觀地反映出來。其中響應(yīng)面圖底部的等高線可以反映兩因素相互作用的強弱，橢圓形表示兩因素相互作用較強，圓形表示較弱[15-16]。圖5 為發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對醋酸生成量的影響，由圖可知，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對醋酸生成量的交互作用較強，發(fā)酵時間較發(fā)酵溫度對醋酸生成量的影響大，表現(xiàn)為等高線較陡和密集。圖6 為發(fā)酵溫度和攪拌速率對醋酸生成量的影響，由圖可知，發(fā)酵溫度和攪拌速率對醋酸生成量的交互作用較強，發(fā)酵時間和攪拌速率對蘋果醋總酸的生成量均有顯著影響。

圖7 為發(fā)酵溫度和接種量對蘋果醋總酸生成量的影響，由圖可知，發(fā)酵溫度和接種量對總酸生成量的交互作用較強，蘋果醋發(fā)酵接種量大于發(fā)酵溫度對總酸生成量的影響。圖8 為發(fā)酵時間和攪拌速率對總酸生成量的影響，由圖可知，發(fā)酵時間和攪拌速率對總酸生成量的交互作用較強，發(fā)酵時間和攪拌速率對蘋果醋總酸生成量均有較大影響。圖9 為發(fā)酵時間和接種量對總酸生成量的影響，由圖可知，發(fā)酵時間和接種量對總酸生成量的交互作用較強，發(fā)酵時間對蘋果醋總酸生成量的影響稍微強于接種量。圖10 為攪拌速率和接種量對總酸生成量的影響，由圖可得，攪拌速率和接種量對總酸生成量的交互作用較強，接種高于攪拌速率對總酸生成量的影響。

2.2.3 最佳工藝參數(shù)的預(yù)測和驗證

運用響應(yīng)面軟件對試驗數(shù)據(jù)進行優(yōu)化和預(yù)測，得到蘋果醋發(fā)酵總酸生成量的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度33℃、發(fā)酵時間39 h、攪拌速率1 529.1 r/min、接種量7.3%，在此工藝參數(shù)下預(yù)測發(fā)酵醪液中醋酸生成量為61.9 g/L。結(jié)合實際生產(chǎn)的可操作性，將醋酸發(fā)酵的工藝參數(shù)改為發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時間39 h、攪拌速率1 500 r/min、醋酸菌接種量7%。在此工藝參數(shù)下對模型的預(yù)測參數(shù)進行驗證，得到發(fā)酵蘋果醋的總酸含量為62.22 g/L，與模型預(yù)測值很接近，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的醋酸發(fā)酵的工藝參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

以煙臺富士蘋果為原料，通過單因素試驗初步研究了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌轉(zhuǎn)速和接種量對蘋果醋總酸生成量的影響。通過響應(yīng)面分析方法建立了蘋果醋總酸發(fā)酵工藝參數(shù)，即發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌轉(zhuǎn)速、接種量對蘋果醋發(fā)酵總酸含量之間的響應(yīng)面模型，可用于蘋果醋發(fā)酵總酸含量的預(yù)測。在響應(yīng)面試驗所取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌轉(zhuǎn)速、接種量參數(shù)的優(yōu)化區(qū)間內(nèi)，發(fā)酵溫度對蘋果醋發(fā)酵總酸含量影響不顯著，發(fā)酵時間對蘋果醋發(fā)酵總酸含量影響極顯著，攪拌轉(zhuǎn)速和接種量對蘋果醋發(fā)酵總酸含量具有顯著影響，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、攪拌轉(zhuǎn)速和接種量各因素交互作用對總酸含量的影響不顯著。試驗得出，蘋果醋發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時間39 h、攪拌速率1 500 r/min、醋酸菌接種量7%。