微藻類胡蘿卜素生物合成代謝途徑的研究進(jìn)展

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(1.江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室,江蘇海洋大學(xué),江蘇連云港 222005; 2.江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室,江蘇海洋大學(xué),江蘇連云港 222005)

類胡蘿卜素(Carotenoids)是一類天然的脂溶性色素的總稱,在自然界中分布廣泛,普遍存在于高等植物、微生物、藻類及少數(shù)動物之中[1-3],是一類由異戊二烯構(gòu)成的萜類化合物,其基本單位是異戊二烯單位,主要由8個異戊二烯單位首尾相連形成[4]。

植物是類胡蘿卜素的天然合成器,類胡蘿卜素主要存在于高等植物的葉綠體中[5],是光合系統(tǒng)的重要組成部分之一。類胡蘿卜素可作為光合作用的輔助色素,保護葉綠素分子在光照條件下不被光氧化而破壞,清除光合作用中產(chǎn)生的氧自由基使膜脂和膜蛋白免受破壞、以及穩(wěn)定類囊體[6-7],賦予了植物葉、花朵和果實鮮艷色彩,吸引昆蟲和鳥類為其傳播花粉和種子,是光合天線和反應(yīng)中心復(fù)合體不可缺少的結(jié)構(gòu)成分[8-9]。

大多數(shù)動物不能自動合成類胡蘿卜素,必須通過攝入植物體食物來提供動物體內(nèi)所需的類胡蘿卜素。類胡蘿卜素在動物機體內(nèi)具有改善免疫系統(tǒng)、抑制及預(yù)防癌癥、延緩衰老、改善肝臟損傷,同時又是一種營養(yǎng)性強抗氧化劑,可促進(jìn)細(xì)胞縫隙間聯(lián)接交流,可有效抑制一些慢性疾病的發(fā)生[7-8,10-11]。

微藻(Microalgae)是藻類的一種,是一類需要用顯微鏡才能觀察到的微小又能進(jìn)行光合自養(yǎng)的群體藻類[12],以單細(xì)胞型存在于自然界中,因其富含類胡蘿卜素、維生素、類固醇、蛋白質(zhì)、多糖、碳水化合物和脂肪酸等生物活性化合物[13],而被廣泛用于食品、藥品、化妝品等多種行業(yè)[14-16],甚至應(yīng)用于環(huán)境治理[17]。又因微藻生長速度快、適應(yīng)性強、生長不受季節(jié)影響,因此越來越多的人們選擇微藻作為提取類胡蘿卜素的主要原料。于是與類胡蘿卜素產(chǎn)量戚戚相關(guān)的代謝途徑相關(guān)研究也就越來越受到人們的青睞[18]。本文就微藻中類胡蘿卜素的分類、分布及特點,類胡蘿卜素生物合成代謝途徑和其過程中的相關(guān)基因以及基因克隆現(xiàn)狀進(jìn)行了闡述,為微藻類胡蘿卜素代謝途徑以及以微藻為類胡蘿卜素生物合成器的深化研究提供參考資料。

1 類胡蘿卜素的分類、分布及特點

1.1 類胡蘿卜素的分類

目前發(fā)現(xiàn)的天然類胡蘿卜素已達(dá)750多種[3],種類隨其分類依據(jù)不同而不同。以其代謝途徑,可將類胡蘿卜素可以區(qū)分為初級類胡蘿卜素和次級類胡蘿卜素兩大類[19-20];以其是否含氧原子,可分為不含氧原子的烴類胡蘿卜素[21]和含有氧原子的含氧衍生物,前者只含有碳、氫兩種元素,主要有β-胡蘿卜素、番茄紅素等,后者含有碳、氫、氧三種元素如葉黃素、玉米黃素等[22];以其結(jié)構(gòu)中端環(huán)的存在與否,又可被分為環(huán)狀或非環(huán)狀類胡蘿卜素[2];以其碳原子的數(shù)量,則可分為C30、C40、C45、C50類胡蘿卜素[2]等。

同時,類胡蘿卜素包括四個亞族:一是胡蘿卜素,如α-、β-、γ-胡蘿卜素、番茄紅素;二是胡蘿卜醇,如葉黃素、玉米黃素、蝦青素;三是胡蘿卜醇的酯類,如β-阿樸-8′-胡蘿卜酸酯;四是胡蘿卜酸,如藏紅素、胭脂樹橙[23]。

1.2 類胡蘿卜素在微藻中的分布及特點

很多藻類可合成類型各異的類胡蘿卜素[5],其中微藻包括藍(lán)藻門、綠藻門、裸藻門、金藻門、甲藻門、隱藻門、黃藻門、硅藻門等九個門,其不同門含有不同的類胡蘿卜素,主要包括β-胡蘿卜素、葉黃素和蝦青素等[24],詳見表1。不同門的微藻所含的類胡蘿卜素種類見表2。

表2 不同微藻中所含的類胡蘿卜素Table 2 Carotenoids in different microalgae

表1 藻類所含的類胡蘿卜素種類Table 1 The carotenoid species in algae

縱觀類類胡蘿卜素合成代謝途徑,番茄紅素(Lycopene)是類胡蘿卜素合成途徑中的一個重要的中間物質(zhì),該物質(zhì)在不同酶的作用下,生成不同的類胡蘿卜素,其中一個分支最終產(chǎn)物為葉黃素(Lutein),另一分支生成β-胡蘿卜素(β-Carotene)后在不同酶的作用下最終生成蝦青素(Astaxanthin)和新黃質(zhì)(Neoxanthin)。在查閱大量文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)微藻中新黃質(zhì)含量較少,因此本文著重介紹番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素和蝦青素四種主要類胡蘿卜素。

1.2.1 番茄紅素 番茄紅素(Lycopene)的化學(xué)式為C40H56,能夠清除自由基,具有延緩衰老的作用。番茄紅素能夠增強細(xì)胞間隙連接,通過控制細(xì)胞增長和分化來抑制腫瘤細(xì)胞的增長,具有很好的抗癌效果[41]。番茄紅素具有修復(fù)DNA損傷、預(yù)防癌癥、預(yù)防心血管疾病[42-43]。

1.2.3β-胡蘿卜素β-胡蘿卜素(β-Carotene)的化學(xué)式為C40H56,是人類和動物合成維生素A至關(guān)重要的前體物質(zhì),也是一種抗氧化劑[49-51],β-胡蘿卜素有抑制和防止腫瘤的作用,還能控制膽固醇,減少心血管疾病的發(fā)生[52-53]。

1.2.4 蝦青素 蝦青素(Astaxanthin)的化學(xué)式是C40H52O4,是微藻合成的第二個重要的類胡蘿卜素,這種色素是由雨紅球藻產(chǎn)生的酮類胡蘿卜素[15,54]。具有超強的抗氧化活性,對于人體對抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)、抗癌有一定的幫助[24],是維生素類防氧化藥物的維生素E的100倍,被譽為“超級維生素E”[55]。蝦青素可防止生物膜上不飽和脂肪酸被氧化損傷,能中和生物體內(nèi)因特殊物質(zhì)、能量的代謝所產(chǎn)生的超氧陰離子、羥基自由基和單線態(tài)氧,并清除細(xì)胞內(nèi)活性氧,因而具有增強生物體免疫功能、抗擊腫瘤發(fā)生、防止肌膚衰老[56]等多種作用。但是蝦青素與其他已知的類胡蘿卜素有所不同,其不作為維生素A的前體[57]。以上四種類胡蘿卜素的化學(xué)式及結(jié)構(gòu)式見表3[58]。

表3 類胡蘿卜素化學(xué)式及結(jié)構(gòu)式Table 3 Chemical formula and structural formula of carotenoids mentioned above

2 類胡蘿卜素合成代謝途徑

2.1 類胡蘿卜素生物合成的基本途徑

因為類胡蘿卜素的研究始于植物,因此其代謝途徑需從源頭說起。20世紀(jì)50年代,Porter等[59]發(fā)現(xiàn)從雜交番茄中提取出的類胡蘿卜素比普通番茄多,并開始闡述類胡蘿卜素的生物合成機理?？偨Y(jié)發(fā)現(xiàn),在類胡蘿卜素合成代謝途徑中,合成類胡蘿卜素前體物質(zhì)可歸納為兩種模式:一種是在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行反應(yīng)的甲羥戊酸(Mevalonic acid,MVA)途徑(圖1左虛線框內(nèi));另一種就是在細(xì)胞原生質(zhì)體中發(fā)生反應(yīng)的甲基赤蘚糖醇(Methyl erythritol phosphate,MEP)途徑(圖1右實線框內(nèi))[60]。這兩種途徑都產(chǎn)生類胡蘿卜素合成的重要前體物質(zhì)異戊二烯焦磷酸(IPP)及二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP),然后在不同的酶催化下合成不同類型的類胡蘿卜素。通常情況下,哺乳動物和酵母采用MVA途徑,即由乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)開始,生成甲羥戊酸,再生成IPP[61],而所有的高等植物、一部分細(xì)菌和一些綠藻細(xì)胞中,大多是通過MEP途徑[62],即由3-磷酸甘油醛(GA-3-P)和丙酮酸(Pyruvate)經(jīng)過一系列酶生成IPP。微藻中的類胡蘿卜素是采用MEP代謝途徑合成類胡蘿卜素前體物質(zhì)IPP的[63-65]。

圖1 類胡蘿卜素生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis of carotenoids注:*表示類胡蘿卜素合成途徑中已經(jīng)克隆基因的酶。

由圖1可見,類胡蘿卜素合成過程中的關(guān)鍵步驟是從合成IPP開始,IPP在IPPI基因(Idi)作用下生成DMAPP,DMAPP在Idi作用下又合成IPP,此時3分子IPP和1分子DMAPP共同在GPS基因(CrtE)調(diào)控下生成GPP;隨后GPP通過兩個步驟合成中間產(chǎn)物GGPP,首先GPP在FPS催化作用下合成FPP,FPP又在GGPS基因(CrtE)作用下生成GGPP,此后2分子GGPP在PSY基因(CrtB)的調(diào)控下縮合成第一個類胡蘿卜素Phytoene[66];Phytoene經(jīng)過PDS基因(CrtP)、Z-ISO基因(CrtH)、ZDS基因(CrtQ)和CrtISO基因4個調(diào)控過程后生成Lycopene;Lycopene在LYCE基因(CrtL-e)和LYCB基因(CrtL-b)作用下分別生成α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素[67-68],最后再生成其他類胡蘿卜素;在β-胡蘿卜素在BKT基因(CrtO)調(diào)控下合成Astaxanthin[69]。

MVA途徑合成物質(zhì):Acetyl-CoA:乙酰輔酶A;Acetoacetyl-CoA:乙酰乙酰輔酶A;HMG-CoA:3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA;MVA:甲羥戊酸;MVP:甲羥戊酸-5-磷酸;MVPP:甲羥戊酸-5-二磷酸。所需的酶:AACT:乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶;HMGS:HMG-CoA合成酶;HMGR:HMG-CoA還原酶;MVK:甲羥戊酸激酶;PMVK:甲羥戊酸磷酸激酶。

MEP途徑合成物質(zhì):Pyruvate:丙酮酸;G3P:3-磷酸甘油醛;1-DX-5P:1-脫氧木酮糖-5-磷酸;2C-MEP-4P:2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸;CDP-ME:二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖;CDP-MEP:4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2-磷酸;MEP-CPP:2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2,4-環(huán)二磷酸;HMBPP:E-4-羥基3-甲丁-2-烯基二磷酸。所需的酶:DXS:1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶;DXR:1-脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶;MCT:2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶;MCK:2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-胞苷二磷酸激酶;MCS:2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2,4-環(huán)焦磷酸合酶;HDS:1-羥基-2-甲基-2-丁烯基-4-磷酸合酶;IDS:IPP/DMAPP合酶。

兩種途徑相同的合成物質(zhì):IPP:異戊二烯焦磷酸;DMAPP:二甲基丙烯焦磷酸;GPP:牻牛兒基焦磷酸;FPP:法尼基焦磷酸;GGPP:牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸;Phytoene:八氫番茄紅素;Phytofluene:六氫番茄紅素;ζ-carotene:ζ-胡蘿卜素;Neurosporene:鏈孢紅素;Lycopene:番茄紅素;δ-Carotene:δ-胡蘿卜素;α-Carotene:α-胡蘿卜素;Lutein:葉黃素;γ-Carotene:γ-胡蘿卜素;β-Carotene:β-胡蘿卜素;β-cryptoxanthin:β-隱黃質(zhì);Zeaxanthin:玉米黃質(zhì);Antheraxanthin:花藥黃質(zhì);Violaxanthin:紫黃素或堇菜黃質(zhì);Neoxanthin:新黃質(zhì);Echinenone:海膽酮;Canthaxanthin:角黃素;Astaxanthin:蝦青素。所需的酶:IPPI:IPP異構(gòu)酶;GPS:牻牛兒基二磷酸合成酶;FPS:FPP合成酶;GGPS:牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶;PSY:八氫番茄紅素合成酶;PDS:八氫番茄紅素脫氫酶;Z-ISO:ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶;ZDS:ζ-胡蘿卜素脫氫酶;CRTISO:類胡蘿卜素異構(gòu)酶;LYCE:番茄紅素ε-環(huán)化酶;LYCB:番茄紅素β-環(huán)化酶;CHY:β-胡蘿卜素羥化酶;ECH:ε-環(huán)羥化酶;BCH:β-環(huán)羥化酶;ZEP:玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶;VDE:堇菜黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶;NXS:新黃質(zhì)合成酶;BKT:β-胡蘿卜素酮酶。

2.2 參與類胡蘿卜素生物代謝合成的相關(guān)基因及基因克隆現(xiàn)狀

類胡蘿卜素生物合成基因首次由Armstrong等從莢膜紅細(xì)菌(Rhodobactercapsulatus)中克隆[5],相繼有學(xué)者闡明了類胡蘿卜素合成途徑相關(guān)酶大多由單個基因編碼[3],涉及類胡蘿卜素生物合成途徑的早期反應(yīng)即從IPP到Lycopene的主要基因有7個,分別為八氫番茄紅素合成酶基因(CrtB),八氫番茄紅素脫氫酶基因(CrtI)[70],ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶基因(Z-ISO),ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因(CrtQ),胡蘿卜素異構(gòu)酶基因(CrtISO),番茄紅素β-環(huán)化酶基因(CrtL-b),番茄紅素ε-環(huán)化酶基因(CrtL-e)[7,71]。大量研究資料顯示,藍(lán)藻和綠藻只進(jìn)行MEP途徑[72],其中1-脫氧木糖醇-5-磷酸合酶(DXS)和1-脫氧木糖醇-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)是MEP途徑中最為關(guān)鍵的2個代謝酶[73],合成的第一個類胡蘿卜素是八氫番茄紅素(Phytoene)[74],并且八氫番茄紅素合成酶(PSY)基因是類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵基因[74-75]。Steinbrenner等[76]對PDS基因進(jìn)行突變,提高了雨生紅球藻中蝦青素含量。Qi等[77]對類胡蘿卜素生物合成和降解過程中涉及的9個基因的表達(dá)進(jìn)行了6個發(fā)育階段的監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)除葉黃素外的其他類胡蘿卜素含量均增加。

資料顯示,目前有150多個參與合成類胡蘿卜素的基因從植物、藻類、細(xì)菌和真菌中被克隆,編碼20多種不同的酶[78-82]。顧青等[83]和Jim等[72]介紹了被克隆的類胡蘿卜素合成酶種類,歸納如表4。

表4 參與類胡蘿卜素合成的酶Table 4 Enzymes involved in carotenoid synthesis

在類胡蘿卜素合成代謝途徑中,參與其催化作用的主要酶且目前研究較多的已被克隆的酶有合成酶、異構(gòu)酶、脫氫酶、環(huán)化酶、羥化酶、酮酶等。

2.2.1 合成酶 參與類胡蘿卜素合成的重要的合成酶有牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPS)和八氫番茄紅素合成酶(PSY)。法尼基焦磷酸(FPP)經(jīng)過GGPS催化后形成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP),GGPP是合成類胡蘿卜素的前體物質(zhì)[84];而后PSY催化GGPP合成八氫番茄紅素(Phytoene),八氫番茄紅素是第一個類胡蘿卜素[74]。GGPS的表達(dá)量與類胡蘿卜素積累之間存在正相關(guān)關(guān)系,上調(diào)GGPS能夠促進(jìn)類胡蘿卜素的積累[85]。PSY是第一個關(guān)鍵限速酶,是決定碳源對類胡蘿卜素通量的調(diào)控點[86-87],其基因CrtB是類胡蘿卜素合成途徑中重要的目的基因[88-90],有研究對普通小球藻中PSY基因進(jìn)行克隆,表明其有利于提高類胡蘿卜素產(chǎn)量[91],更多研究發(fā)現(xiàn)PSY的過度表達(dá)能夠增加β-胡蘿卜素的含量[92-93]。Cordero等[94]將綠藻中的PSY基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻,重組藻株中紫黃質(zhì)和葉黃素分別提高了2倍和2.2倍。

2.2.2 脫氫酶 八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)是類胡蘿卜素合成過程中重要的去飽和限速酶[67]。Lagarde等[95]用酵母PDS基因CrtP轉(zhuǎn)化集球藻(Synehococcus),葉黃素和玉米黃質(zhì)均增加了50%;Liu等[96]將萊茵衣藻中PDS基因進(jìn)行修飾,其類胡蘿卜素含量增加,在小球藻中表達(dá)PDS基因,其類胡蘿卜素含量也增加[97]。

2.2.3 異構(gòu)酶 類胡蘿卜素合成途徑中重要的異構(gòu)酶包括異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶(IPPI)和胡蘿卜素異構(gòu)酶(CRTISO)。IPP和DMAPP在IPPI的催化作用下可相互轉(zhuǎn)換,而后IPP和DMAPP共同作用合成牻牛兒基焦磷酸(GPP)。CRTISO又包括ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶(Z-ISO),Z-ISO異構(gòu)化六氫番茄紅素(Phytofluene)生成ζ-胡蘿卜素,而后生成的鏈孢紅素(Neurosporene),其在CRTISO催化作用下生成番茄紅素(Lycopene)。Fang等[98]研究發(fā)現(xiàn)CRTISO突變會導(dǎo)致葉黃素含量顯著降低;Wang等[71]研究發(fā)現(xiàn),在類胡蘿卜素合成途徑中Z-ISO的缺失并沒有導(dǎo)致類胡蘿卜素合成的中斷。Lagarde等[95]用酵母的IPPI基因Idi轉(zhuǎn)化集球藻,類胡蘿卜素含量不受影響。

2.2.4 環(huán)化酶 番茄紅素環(huán)化酶(LYC)也是類胡蘿卜素生物合成關(guān)鍵酶之一,分為番茄紅素β-環(huán)化酶基因(CrtL-b)和番茄紅素ε-環(huán)化酶基因(CrtL-e)[84]。番茄紅素在兩種不同酶的作用下生成不同的類胡蘿卜素,一條途徑連續(xù)經(jīng)過兩次LYCB催化后合成β-胡蘿卜素;另一條途徑則先經(jīng)過LYCE催化后再由LYCB催化得到α-胡蘿卜素。LYCB基因CrtL-b能夠增加β-胡蘿卜素和總類胡蘿卜素[99]。Ye等[100]已經(jīng)克隆和測序了杜氏鹽藻中的LYC;Wisutiamonkul等[101]發(fā)現(xiàn)LCYB基因的表達(dá)水平能夠控制β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素的積累;抑制LYCE能增加β-胡蘿卜素的積累[102-104]。

2.2.5 酮酶和羥化酶β-胡蘿卜素酮酶(BKT)和β-胡蘿卜素羥化酶(CHY)是合成蝦青素的兩個關(guān)鍵酶[105],β-胡蘿卜素經(jīng)過BKT兩步催化后先得到角黃素(Canthaxanthin),隨后在CHY調(diào)控下最終形成次級類胡蘿卜素——蝦青素。CHY包括β-環(huán)羥化酶(BCH)和ε-環(huán)羥化酶(ECH)。Zhong等[106]發(fā)現(xiàn)單獨將萊茵衣藻的BKT基因轉(zhuǎn)入植物中時,蝦青素的產(chǎn)量并不高,當(dāng)BKT基因來源于不同的藻類時,β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為角黃素,玉米黃質(zhì)轉(zhuǎn)化為蝦青素,使類胡蘿卜素含量增加;Mann等[107]將雨生紅球藻的BKT基因CrtO轉(zhuǎn)入到煙草中,促使β-胡蘿卜素合成蝦青素;周洋洋等[105]將衣藻β-胡蘿卜素加酮酶基因CrBKT載入授粉5天的南瓜中,發(fā)現(xiàn)南瓜中類胡蘿卜素的含量增加了1/3;尹航等[31]誘導(dǎo)綠色杜氏藻中CHY基因的表達(dá),其葉黃素和玉米黃素含量分別是原來的2.95倍和2.33倍;Chang等[82]將藻類β-胡蘿卜素羥化酶基因整合到酵母中,設(shè)計的類胡蘿卜素生物合成途徑可提高酵母中類胡蘿卜素的產(chǎn)量;Lagarde等[95]用酵母的CHY基因CrtR轉(zhuǎn)化集球藻,玉米黃質(zhì)含量較原來增加了2.5倍。

3 展望

綜上所述,20世紀(jì)50年代,人們就開始闡述類胡蘿卜素的生物合成代謝機理,并克隆了參與類胡蘿卜素合成途徑的大部分酶,為進(jìn)一步提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量和質(zhì)量,建議加強以下幾個方面的相關(guān)工作。

微藻克隆合成IPP前參與類胡蘿卜素生物代謝合成的相關(guān)基因,如前文所述,在MEP途徑中,合成IPP之前所參與的酶如:DXS、DXR、MCT、MCK、MCS、HDS、IDS等酶的研究較少,且克隆的合成類胡蘿卜素相關(guān)酶的基因還未克隆。因此,在合成IPP前,參與類胡蘿卜素生物代謝合成的相關(guān)基因克隆,或成為未來類胡蘿卜素代謝基因工程的研究方向。

在類胡蘿卜素生物代謝合成β-胡蘿卜素后,合成蝦青素的分支參與的酶已被克隆,但β-胡蘿卜素在CHY催化作用下合成玉米黃質(zhì)后,繼續(xù)合成新黃質(zhì)的途徑中所參與的酶ZEP、VDE、NXS的相關(guān)基因還未被克隆。因此克隆后期合成新黃質(zhì)階段所參與的酶的基因,對合成類胡蘿卜素及代謝途徑的研究有一定的意義。

由于微藻的生長周期短、易于培養(yǎng),且富含類胡蘿卜素,因此以微藻作為生物反應(yīng)器開展類胡蘿卜素代謝途徑的研究可節(jié)約大量時間,并且類胡蘿卜素含量變化也易于檢測。但是由于微藻需在顯微鏡下才能觀察到,所以克隆其基因時可能會出現(xiàn)不易觀察,因此在克隆時可采用標(biāo)記基因的方法,在成功克隆后以利于觀察。