張仲凱，馬秀英，吳 闊，鄭寬瑜，裴衛(wèi)華，陳永對，王田田，吳少政

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，云南 昆明 650223；2.陸良縣大莫古鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 陸良 655607)

【研究意義】云南省陸良縣地處滇中偏東，壩區(qū)平均海拔1900 m左右，在云南屬于冷涼氣候類型，高原夏秋蔬菜已發(fā)展成為農(nóng)民增收的重點產(chǎn)業(yè)，至2018年底，全縣大棚蔬菜基地0.55萬hm2，露地蔬菜基地0.67萬hm2。意大利生菜是陸良縣夏秋蔬菜的大宗產(chǎn)品之一，萵苣類蔬菜種植面積較大的還有油麥菜，萵筍種植面積較少。是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部“云貴高原夏秋淡季蔬菜基地重點縣”、“設(shè)施蔬菜生產(chǎn)重點縣”，至2018年底全縣蔬菜產(chǎn)業(yè)綜合產(chǎn)值120億元，其中種植業(yè)產(chǎn)值16.77億元，是農(nóng)民收入的主要來源，2019年被列入云南省“綠色食品牌”創(chuàng)建示范縣。萵苣類是陸良縣蔬菜的大宗產(chǎn)品，近年來斑萎病發(fā)生危害嚴(yán)重，引起質(zhì)量下降、產(chǎn)量損失以及農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問題突出。明確萵苣類斑萎病的流行病學(xué)，對開展綠色防控、提升產(chǎn)量與品質(zhì)、創(chuàng)建綠色食品牌和保障農(nóng)民增收具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】萵苣類蔬菜包括萵筍、生菜、油麥菜等，在全球范圍內(nèi)廣泛分布，在云南高原夏秋蔬菜中占有重要的比重。病毒病是萵苣類的主要病害，其中花葉病、花葉黃化病、壞死曲葉病、斑萎病等發(fā)生普遍。全球報道侵染萵苣類蔬菜的病毒多達(dá)10余種[1-6]，中國報道的侵染萵苣類蔬菜的病毒主要有萵苣花葉病毒(Lettucemosaicvirus，LMV)，黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV),蒲公英黃色花葉病毒(Dandelionyellowmosaicvirus，DYMV)[7]，煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)，馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)[8],番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltorthotospovirus，TSWV)[9]。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，TSWV引起的斑萎病是云南萵苣類蔬菜的主要病害，發(fā)病率在10 % ～ 90 %，個別田塊引起絕產(chǎn)[9]，但是侵染陸良萵苣類蔬菜的病毒尚未檢測鑒定。目前，國內(nèi)外尚未對萵苣類病毒病的流行病學(xué)開展研究，制約對該類病害有針對性的綠色防控技術(shù)的制定和實施?！颈狙芯壳腥朦c】從田間發(fā)生流行特點、病原、中間寄主、種苗帶毒率等系統(tǒng)研究陸良縣萵苣類蔬菜斑萎病的侵染循環(huán)及其發(fā)生流行特點?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確陸良萵苣類蔬菜斑萎病的初侵染源、侵染循環(huán)及其發(fā)生流行特征，為陸良及云南高原萵苣類蔬菜斑萎病的綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

材料：2019年7-8月，采集陸良縣萵苣類蔬菜產(chǎn)區(qū)意大利生菜(Lactucasativavar.ramosaHort-Italy)、萵筍(Lactucasativavar.angustanaIrish)不同發(fā)病時期的斑萎病樣品，同時采集菜地周邊雜草和作物表現(xiàn)為疑似斑萎病的鬼針草(Bidenspilosa)、辣椒(Capsicumannuum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、烤煙K326(Nicotianatobacumvar.K326)，以及苗棚中的意大利生菜種苗。其癥狀表現(xiàn)見圖1。

主要試劑：酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測用植物病毒抗體見表1。電子顯微鏡制樣試劑，參照文獻(xiàn)[10]中的方法配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 調(diào)查采樣 采用隨機(jī)調(diào)查法，在生菜與萵筍不同生長時期的生產(chǎn)地塊調(diào)查主要病害種類及其發(fā)病率，根據(jù)病害的分布、發(fā)病率及其對產(chǎn)量、質(zhì)量的影響確定主要病害。采集無癥、不同發(fā)病程度的植株樣品。在菜地周圍調(diào)查和采集具有與主要病害癥狀相似的雜草及作物植株，通過檢測確定是否為引起主要病害病毒的中間寄主。針對主要品種為意大利生菜，對苗棚生產(chǎn)種苗進(jìn)行調(diào)查和采樣。

1.2.2 電子顯微鏡負(fù)染色、超薄切片制樣與觀察 參照張仲凱等[11]的方法進(jìn)行。制備樣品置于FEI(TaicnaiG2 Spirit)透射電子顯微鏡觀察、拍照。根據(jù)負(fù)染色電子顯微鏡觀察結(jié)果，初步推測與主要病害伴隨的病毒可能的歸屬，安排ELISA檢測的植物病毒抗體種類。根據(jù)超薄切片制樣電子顯微鏡觀察結(jié)果，進(jìn)一步明確病毒種類及中間寄主。

表1 ELISA檢測用植物病毒抗體

1.2.3 ELISA檢測 根據(jù)電子顯微鏡負(fù)染色觀察結(jié)果，在陸良萵苣類斑萎病樣品中僅觀察到正番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus)病毒(orthotospoviruses)粒體，采用云南滇中地區(qū)發(fā)生頻率較高的7種orthotospoviruses抗體(表1)，參照文獻(xiàn)[12]中的方法進(jìn)行間接ELISA檢測，確定具體種類、中間寄主及種苗帶毒率。判斷含有病毒的標(biāo)準(zhǔn)為檢測樣品ELISA OD值與陰性對照或PBS的OD值比值大于1.5即判斷為病毒陽性樣品，并將OD比值大于1.5的樣品分為4個級別，比值1.5 ～ 3.0為“+”，3.0 ～ 5.0為“++”，5.0 ～ 7.0為“+++”，7.0以上為“++++”，低于1.5比值為陰性樣品，以“-”表示。并根據(jù)以上調(diào)查與采樣檢測結(jié)果分析陸良萵苣類蔬菜斑萎病的初侵染源、侵染循環(huán)及其發(fā)生流行特點，初步確定其流行病學(xué)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸良萵苣類蔬菜的主要病害及其發(fā)生特點

經(jīng)走訪和實地調(diào)查，陸良萵苣類夏秋蔬菜的主要病害為斑萎病，當(dāng)?shù)夭宿r(nóng)稱為“癩病”，典型癥狀為葉片皺縮，黃化及密布壞死斑點，嚴(yán)重的致植株死亡，其它病害發(fā)生率低。斑萎病對陸良意大利生菜的產(chǎn)量和質(zhì)量影響較大，不同地塊發(fā)病率在15 %～36 %，發(fā)病初期的植株葉片表現(xiàn)為褪綠，中期為黃化和部分壞死，后期為矮化、皺縮直至植株死亡(圖1-a～c)。油麥菜斑萎病發(fā)病率大部分低于1 %，對產(chǎn)量和質(zhì)量影響較小。萵筍斑萎病的發(fā)病率大部分達(dá)到90 % ～ 100 %，但因種植面積小而影響不大。

a: 意大利生菜斑萎病早期癥狀；b: 意大利生菜斑萎病中期癥狀；c: 意大利生菜斑萎病晚期癥狀；d：斑萎病引起的意大利生菜顯著減產(chǎn)(缺塘為枯死植株拔除)；e：萵筍斑萎病發(fā)病地塊；f：萵筍斑萎病典型病株

意大利生菜從移栽到收獲平均為28 d，因種植戶、種苗來源不同，斑萎病的發(fā)生有較大差異。從移栽至還苗，癥狀表現(xiàn)不明顯。還苗期后，發(fā)病程度差異較大。同一地塊不同發(fā)病時期并存，表明病害在田間表現(xiàn)為多次傳播。移栽后20 d開始發(fā)病的，減產(chǎn)程度較小，對質(zhì)量影響較大。移栽后10 d開始發(fā)病的，在20 d后植株不同程度死亡，引起嚴(yán)重減產(chǎn)(圖1-d)。從田間集中發(fā)病及具有明顯的發(fā)病中心的情況表明，種苗帶病及移栽后進(jìn)一步傳播是陸良意大利生菜斑萎病發(fā)病率較高的原因。

2.2 陸良萵苣類蔬菜斑萎病樣品中的主要病毒種類

對采集的樣品進(jìn)行負(fù)染色制樣，電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)主要含有直徑80～90 nm的被膜球形病毒粒體，大部分病毒粒體呈簇狀聚集，外層有囊泡包裹，是典型的orthotospoviruses粒體的形態(tài)特征(圖2-a)。超薄切片制樣，電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)無癥樣品細(xì)胞中，葉綠體、線粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)中無病毒粒體分布(圖2-b)；具斑萎病癥狀樣品細(xì)胞質(zhì)中分布大量直徑約85 nm的球形病毒粒體，有雙層膜的單個病毒粒體，大部分為多個粒體聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜參與形成的囊泡中，具有典型的TSWV侵染的細(xì)胞內(nèi)病毒粒體聚集特征(圖2-c)[13]。結(jié)合癥狀分析，推測陸良萵苣類蔬菜斑萎病由orthotospoviruses侵染引起。應(yīng)用滇中地區(qū)發(fā)生普遍的7種orthotospoviruses的抗體進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果表明，陸良萵苣類蔬菜斑萎病樣品中伴隨的病毒種類是TSWV(表2)。

a: 斑萎病樣品的負(fù)染色觀察；b: 無癥對照樣品的細(xì)胞病理切片觀察；c: 斑萎病樣品的細(xì)胞病理切片觀察; V: 病毒粒子

a: 鬼針草花葉黃化； b： 煙草斑萎；c： 辣椒花葉； d: 馬鈴薯褪綠斑萎

表2 萵苣類蔬菜及其它植物斑萎病樣品的ELISA檢測結(jié)果

2.3 侵染陸良萵苣類蔬菜的TSWV的主要中間寄主植物

應(yīng)用7種orthotospoviruses的抗體對萵苣類蔬菜地周圍采集的鬼針草、馬鈴薯、辣椒疑似斑萎病樣品檢測(圖3)，表明這些樣品被TSWV侵染(表2)。從TSWV在田間的發(fā)生流行特點分析，上述雜草及作物是侵染陸良萵苣類蔬菜的TSWV的中間寄主植物。

2.4 陸良萵苣類蔬菜斑萎病的侵染循環(huán)

對大棚育苗的意大利生菜種苗應(yīng)用TSWV單克隆抗體進(jìn)行ELISA檢測。結(jié)果表明，7株樣品中有7株呈陽性反應(yīng)，即TSWV種苗帶毒率為100 %。

陸良地處中高海拔冷涼氣候類型，在12月份至翌年1月份由于氣溫偏低，多種作物不能生長，只有鬼針草等部分雜草周年生長，且分布廣泛。綜合以上實驗結(jié)果分析，感染TSWV的鬼針草是陸良萵苣類蔬菜斑萎病的初侵染源，在生菜等育苗季節(jié)(一般為每年3月份至10月份)，通過傳毒介體薊馬傳播到萵苣以及馬鈴薯、辣椒、烤煙等中間寄主植物上。帶毒種苗在田間種植過程中，通過薊馬與農(nóng)事操作進(jìn)一步形成多次侵染。到后期發(fā)病率不斷提高，危害加劇。TSWV在陸良萵苣秋蔬菜生產(chǎn)區(qū)以鬼針草-萵苣種苗-萵苣大田生長植株/中間寄主作物(馬鈴薯、辣椒、烤煙等)-鬼針草形成侵染循環(huán)。

3 討 論

萵苣類蔬菜病毒病在全球范圍內(nèi)因區(qū)域不同有較大差異，除LMV、DYMV、CMV、TSWV外，其它地區(qū)報道的還有萵苣黃花葉病毒(LYMV)、萵苣壞死曲葉病毒(LNLCV)、番茄不孕病毒(TAV)、萵苣褪綠病毒(LCV)、萵苣壞死黃化病毒(LYNV)、鳳仙花壞死斑點病毒(INSV)、萵苣斑駁病毒(LMoV)[14-18]。其中，INSV屬于Orthotospovirus，同樣由薊馬傳播，在澳大利亞生菜生產(chǎn)中危害嚴(yán)重。

云南萵苣類蔬菜病毒病原目前鑒定的僅有TSWV[9]，在全省萵苣類蔬菜產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生分布，是云南萵苣類蔬菜病毒的優(yōu)勢種，早期侵染導(dǎo)致植株枯死，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，中后期侵染在葉部和萵筍莖韌皮部產(chǎn)生壞死斑點，對萵苣產(chǎn)量和質(zhì)量造成不同程度的損失。對陸良縣萵苣類蔬菜生產(chǎn)調(diào)查中，還發(fā)現(xiàn)由于病毒病發(fā)生危害嚴(yán)重，菜農(nóng)誤施或過量施用化學(xué)農(nóng)藥與激素的問題極為突出，農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題嚴(yán)重。由于生菜、油麥菜、萵筍等萵苣類蔬菜是云南高原夏秋外銷蔬菜的大宗產(chǎn)品，斑萎病的發(fā)生與農(nóng)藥殘留超標(biāo)嚴(yán)重制約菜農(nóng)增收。目前對萵苣類斑萎病尚無特效的防治農(nóng)藥，前期研究表明，植物源天然產(chǎn)物類二萜化合物對煙草花葉病毒(TMV)具有明顯的抑制活性[19]，可作為預(yù)防萵苣類斑萎病的生物源抗病毒制劑。明確萵苣類蔬菜斑萎病的初侵染源、侵染循環(huán)途徑，對于開展早期監(jiān)測預(yù)防和綠色防控技術(shù)措施的制定和實施、促進(jìn)菜農(nóng)穩(wěn)產(chǎn)增收具有重要的指導(dǎo)意義。

4 結(jié) 論

本研究明確了陸良萵苣類蔬菜斑萎病主要由TSWV侵染引起。鬼針草是重要的初侵染源，通過傳毒介體薊馬傳播到萵苣類種苗及馬鈴薯、辣椒、煙草等作物上，并通過傳毒介體薊馬和農(nóng)事操作繼續(xù)在這些作物上形成多次侵染，發(fā)生危害逐漸加劇，TSWV在鬼針草中越冬，形成翌年的初侵染源。因此，對初侵染源尤其是萵苣類蔬菜苗棚周圍的鬼針草防除將有效減輕病毒的傳播，同時，必須加強(qiáng)苗期傳毒介體薊馬的防治，對種苗進(jìn)行適時監(jiān)測與預(yù)防，篩選應(yīng)用無病毒或低帶毒率種苗，從源頭控制TSWV的危害。在大田生產(chǎn)期，應(yīng)加強(qiáng)早期檢測和監(jiān)測預(yù)警，應(yīng)用黃藍(lán)板、性信息誘集素殺蟲燈等加強(qiáng)對薊馬的防治，應(yīng)用低毒低殘留及生物源抗病毒農(nóng)藥或制劑預(yù)防斑萎病，對提高萵苣類蔬菜的產(chǎn)量、質(zhì)量、綠色食品牌的創(chuàng)建具有重要意義。