孫 磊，陶 勇

0引言

愛帕琳肽(Apelin/APLN)是由77個氨基酸構(gòu)成的多肽，為血管緊張素樣G蛋白偶聯(lián)受體(APJ)的配體[1]。Apelin-13是Apelin的亞型之一，在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及消化系統(tǒng)中發(fā)揮重要生物學作用[2]。Müller細胞為脊髓動物視網(wǎng)膜中的主要神經(jīng)膠質(zhì)細胞，表達多種功能性的酶，對視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能維持具有重要作用[3]。生理條件下，Müller細胞能支持血-視網(wǎng)膜屏障的完整性，而病理條件下其可參與視網(wǎng)膜水腫形成[4]。研究顯示，Apelin能誘導Müller細胞對缺氧或葡萄糖剝奪的耐受[5]。另有研究報道，Apelin-13通過GLP-1R/PI3K/Akt信號通路抑制神經(jīng)細胞凋亡，并減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷[6]。還有研究顯示，Apelin-13可能通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein，GFAP)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達從而介導Müller細胞的增殖、遷移及存活[7]。提示，Apelin-13與Müller細胞存活或凋亡有關。yes相關蛋白(yes-associated protein，YAP)為一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，主要在Hippo通路下游發(fā)揮細胞增殖和凋亡調(diào)控作用[8]。目前，還未有研究報道YAP是否與Apelin-13介導的細胞存活或凋亡相關，本研究主要對此進行探討。

1材料和方法

1.1材料胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；YAP抗體(貨號4912)、GFAP抗體(貨號80788S)、Phospho-YAP(Ser127)(D9W2I)抗體(貨號13008)、Phospho-LATS1(Ser909)抗體(貨號9157)購自美國CST公司；LATS1抗體購自美國abcam公司(貨號ab70561)；GAPDH抗體(貨號AP0063)、抗兔IgG-HRP二抗(貨號BS13278)、抗小鼠IgG-HRP二抗(貨號BS12478)購自南京巴傲得公司；總蛋白提取試劑盒和細胞裂解液購自上海碧云天公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自美國Millipore公司。主要儀器設備：Elx808全波段多功能酶標儀，美國BioTek公司；AI600凝膠成像儀，美國GE公司；PIPETMAN L微量可調(diào)加樣器，法國Gilson公司產(chǎn)品； Allegra 64R Centrifuge臺式高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；Eclipse Ti-s倒置顯微鏡，日本Nikon公司。

1.2方法

1.2.1 Müller細胞的提取分離和培養(yǎng)將新西蘭乳兔處死，迅速取下眼球，用含慶大霉素(10U/mL)的生理鹽水沖洗2～3次，去掉眼前部組織及玻璃體，剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜神經(jīng)層，沖洗掉粘著的色素上皮細胞，鋪平視網(wǎng)膜組織，撕下不含血管和髓放線的部分組織，用Ⅳ型膠原酶(1mg/mL)和0.2%透明質(zhì)酸酶(100U/mL)消化30～40min，以DMEM/F12(含10% FBS)終止消化，吹散細胞并用100μm濾網(wǎng)過濾，800r/min離心5min后棄去上清，用DMEM/F12(含20% FBS)重懸細胞并接入培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后每隔1d換液，生長至80%密度時進行傳代。

1.2.2免疫熒光檢測GFAP和YAP的表達情況將Müller細胞在4%多聚甲醛中固定30min后，室溫下用Triton X-100透核膜10min。用含5% BSA的PBS封閉2h，于4℃下孵育一抗GFAP和YAP(1∶500)過夜，同時以DAPI染核。分別室溫孵育對應熒光二抗2h，PBS洗片后應用熒光顯微鏡觀察拍照，記錄軟件顯示的熒光強度值。

1.2.3結(jié)晶紫染色觀察細胞形態(tài)將Müller細胞接種于6孔板中，當細胞生長至80%密度時進行結(jié)晶紫染色，細胞用PBS輕柔地洗2遍，每孔加入4%多聚甲醛1mL，37℃固定10min，PBS洗2遍，每遍1min，各加入1mL結(jié)晶紫染色液染10min，雙蒸水洗滌后拍照。實驗重復3次。

1.2.4 MTT法檢測細胞活力取Müller細胞鋪于96孔板中，每孔細胞數(shù)為9×103個，以正常條件下培養(yǎng)的Müller細胞作為對照組，缺氧條件下(92% N2、5% CO2和3% O2)以Apelin-13(0、0.01、0.1、1、10μmol/L)處理24h，每組設置5個復孔，同時設置調(diào)零孔。24h時每孔加入10μL MTT溶液，培養(yǎng)箱孵育4h，酶標儀測定OD值(450nm)，計算細胞活力。細胞活力=(Apelin-13組OD值-調(diào)零孔OD值)/(對照組OD值-調(diào)零孔OD值)×100%。

1.2.5 TUNEL染色檢測細胞凋亡將Müller細胞分為對照組、缺氧組和實驗組，對照組細胞培養(yǎng)于正常環(huán)境中，缺氧組細胞培養(yǎng)于缺氧環(huán)境中，實驗組細胞培養(yǎng)于缺氧環(huán)境中并以Apelin-13(1μmol/L)處理24h。將處理好的對照組、缺氧組和實驗組Müller細胞制成懸液后爬片，用固定液固定爬片1h，PBS漂洗，通透液冰上孵育2min，PBS漂洗玻片2次，干燥，加50μL TUNEL染色液于爬片區(qū)避光孵育1h，PBS漂洗3次，加入適量的DAPI染色5～10min，吸出染液，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡下觀察。隨機選取5個非重疊200倍鏡視野拍照，計數(shù)凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算凋亡率。

1.2.6蛋白印跡檢測p-LATS1、p-YAP、LATS1及YAP蛋白表達變化將處理好的對照組、缺氧組和實驗組細胞取出，用蛋白刮刀將貼壁細胞刮下，將細胞懸液收集于10mL離心管，1 200r/min離心5min，棄去上清液，將管內(nèi)液體吸凈，各組細胞加入含RIPA的細胞裂解液(含1mmol/L蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物)，冰上裂解10min，4℃下12 000r/min離心20min,吸取上清液置于冰上備用，BCA法進行定量，制備樣品。SDS-PAGE電泳分離蛋白(各樣品上樣量為30μg)，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉PVDF膜4h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10min；然后按要求加入YAP(1∶2000)、p-YAP(1∶1000)、LATS1(1∶1000)、p-LATS1(1∶1000)或GAPDH抗體(1∶5000)4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，再加入相應的二抗(1∶5000)，室溫孵育1h，以ECL化學發(fā)光液進行顯色，凝膠成像儀進行成像并檢測灰度值。

圖1 Müller細胞的鑒定圖(×200) A：Müller細胞結(jié)晶紫染色；B：Müller細胞以綠色熒光標記的GFAP抗體進行免疫熒光染色(綠色：GFAP染色陽性細胞；藍色：細胞核)。

2結(jié)果

2.1 Müller細胞的鑒定提取分離的Müller細胞傳代后貼壁生長，細胞呈長梭形、多角形、圓形等形態(tài)，細胞質(zhì)豐富，細胞核呈圓形，見圖1A。綠色熒光標記的GFAP抗體染色，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，大部分細胞呈現(xiàn)綠色熒光，見圖1B。

2.2 Apelin-13抵抗缺氧誘導的Müller細胞活力降低MTT實驗結(jié)果顯示，以正常條件下的Müller細胞作為對照組，細胞活力為100%，缺氧條件下0、0.01、0.1、1、10μmol/L Apelin-13處理24h后的Müller細胞活力分別為(61.1±4.3)%、(66.3±4.7)%、(71.5±6.0)%、(82.3±7.1)%、(81.3±7.9)%，組間總體比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=18.56，P<0.0001)。與對照組相比，缺氧(0μmol/L Apelin-13處理組)誘導Müller細胞活力顯著下降(P<0.0001)；而缺氧條件下，與0μmol/L Apelin-13處理組相比，0.01～10μmol/L Apelin-13均能抵抗缺氧誘導的細胞活力下降，其中0.1、1、10μmol/L Apelin-13處理組差異顯著(P=0.041、0.0006、0.0008)，見圖2。

2.3 Apelin-13抵抗缺氧誘導的Müller細胞凋亡TUNEL染色結(jié)果顯示，對照組、缺氧組及實驗組細胞24h凋亡指數(shù)為(3.20±0.03)%、(18.62±1.66)%、(3.86±0.03)%，組間總體比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=413.5，P<0.0001)。與對照組相比，缺氧組凋亡指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)；與缺氧組相比，實驗組細胞凋亡指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)，見圖3。

2.4 Apelin-13抑制缺氧條件下Müller細胞的YAP磷酸化蛋白印記結(jié)果顯示，24h時，對照組、缺氧組及實驗組細胞p-LATS1相對蛋白表達水平為(123.2±7.6)%、(119.8±7.9)%、(29.3±2.0)%，組間差異有統(tǒng)計學意義(F=205.6，P<0.0001)。各組p-YAP相對蛋白表達水平為(156.2±9.3)%、(155.2±9.8)%、(36.5±3.1)%，組間差異有統(tǒng)計學意義(F=205.6，P<0.0001)。與對照組相比，缺氧組細胞p-LATS1和p-YAP蛋白表達無明顯差異；而與缺氧組相比，實驗組細胞p-LATS1和p-YAP蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)，見圖4。

2.5 Apelin-13誘導缺氧條件下Müller細胞YAP入核24h時，對照組、缺氧組及實驗組細胞YAP細胞核熒光強度為68±6、70±6、106±8，組間總體比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=30.26，P=0.0007)。對照組和缺氧組細胞無明顯差異；而與缺氧組相比，實驗組細胞YAP細胞核熒光強度明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0006)，見圖5。

圖2 Apelin-13對缺氧條件下Müller細胞活力的影響bP<0.01vs對照組；cP<0.05，dP<0.01vs0μmol/L Apelin-13組。

3討論

Müller細胞是視網(wǎng)膜組織中主要的膠質(zhì)細胞，幾乎貫穿分布于從內(nèi)界膜到外界膜的視網(wǎng)膜感覺神經(jīng)全層[9]。Müller細胞具有調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜內(nèi)酸堿平衡、參與視網(wǎng)膜細胞代謝、維持視網(wǎng)膜內(nèi)谷氨酸平衡、傳遞神經(jīng)信號及維持視網(wǎng)膜的完整性等重要的生理功能[10-11]。同時，Müller細胞參與多種視網(wǎng)膜病理過程[12]。因此，如何有效調(diào)節(jié)或維持Müller細胞的正常生理功能具有重要意義。

本研究參考文獻方法[13]提取分離了兔Müller細胞。常規(guī)培養(yǎng)條件下發(fā)現(xiàn)細胞傳代后貼壁生長，細胞呈長梭形、多角形、圓形等形態(tài)，細胞質(zhì)豐富，細胞核呈圓形。這與文獻報道的Müller細胞形態(tài)相一致[13]。免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，大部分細胞明顯表達GFAP。Müller細胞屬于膠質(zhì)細胞，而GFAP為膠質(zhì)細胞的重要標志物[9,14]。這些說明本研究成功提取分離出Müller細胞。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，0.1、1、10μmol/L Apelin-13處理24h后明顯抑制缺氧誘導的Müller細胞活力下降，而1μmol/L Apelin-13的抑制效應最好，因此選取此濃度進行后續(xù)實驗。研究顯示，Apelin-13通過GLP-1R/PI3K/Akt信號抑制神經(jīng)細胞凋亡，并減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷[6]。而Müller細胞凋亡可引起多種相關生理功能失調(diào)，最終誘發(fā)眼科疾病。本研究通過TUNEL染色觀察了Apelin-13和Müller細胞凋亡的關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Apelin-13可明顯抑制缺氧誘導的Müller細胞凋亡，這與研究報道的Apelin-13作用相類似。YAP作為一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，主要在Hippo通路下游發(fā)揮作用，可參與凋亡調(diào)控[8]，因此本研究觀察了YAP的變化。實驗發(fā)現(xiàn)缺氧條件下Apelin-13可誘導Müller細胞p-YAP蛋白表達明顯降低，并且還能誘導其上游信號蛋白p-LATS1蛋白表達下調(diào)。提示，p-YAP蛋白表達變化依賴于p-LATS1蛋白。研究已證實，當LATS1磷酸化后可引起下游效應物YAP磷酸化，最終使YAP核轉(zhuǎn)位至細胞質(zhì)中，從而使后者失去轉(zhuǎn)錄活性[15-17]。因此，本研究進一步采用免疫熒光技術(shù)驗證缺氧條件下Apelin-13對YAP核表達的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下，Apelin-13促進YAP的細胞核表達。這些提示，Apelin-13可能通過促進YAP入核從而抵抗缺氧誘導的Müller細胞凋亡。

圖3 各組Müller細胞TUNEL染色結(jié)果(×200)。

圖4 各組蛋白表達變化bP<0.01vs缺氧組。

圖5 Apelin-1對缺氧條件下Müller細胞YAP細胞核表達的影響(×400)。

YAP缺乏明顯的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，需要與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，因此被認為是轉(zhuǎn)錄共激活因子調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄[18]。研究顯示，YAP的活化可引起細胞增殖，同時抑制細胞凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)Apelin-13能抵抗缺氧誘導的Müller細胞凋亡，而該作用可能與促進YAP入核有關。但YAP調(diào)節(jié)的下游信號靶點還不明了，有待于進一步研究。