周歡明，項(xiàng)敏泓，麻 凱，文 杭，趙艷青，劉 江

0引言

結(jié)膜松弛癥(conjunctivochalasis，CCH)是老年人高發(fā)的眼表疾病[1]。隨著健康普及，中國的人口老齡化越來越嚴(yán)重，CCH患者日趨增多。針對老年人CCH發(fā)病率較高的特點(diǎn)，研究證實(shí)細(xì)胞衰老可能是CCH發(fā)病的關(guān)鍵[2-3]。CCH患者出現(xiàn)一系列眼表淚液學(xué)異常，包括流淚、異物感、干澀，嚴(yán)重者出現(xiàn)結(jié)膜下出血、角膜潰瘍影響生活[4]。自擬方劑杞精明目湯應(yīng)用多年，取得一定的治療效果[5-6]，本研究擬進(jìn)一步探討杞精明目湯聯(lián)合治療CCH的臨床效果及對細(xì)胞衰老的影響。

1對象和方法

1.1對象收集2017-01/2018-11在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院眼科確診為CCH的病例共40例80眼，按隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組：聯(lián)合治療組(杞精明目湯聯(lián)合人工淚液)20例40眼，男9例，女11例；年齡71.63±4.76歲；按CCH診斷分級標(biāo)準(zhǔn)[7]：Ⅱ級18眼、Ⅲ級20眼、Ⅳ級2眼。人工淚液組20例40眼，男8例，女12例；年齡70.59±3.57歲；按CCH診斷分級標(biāo)準(zhǔn)[7]：Ⅱ級20眼、Ⅲ級19眼、Ⅳ級1眼。兩組性別、年齡、眼別、CCH級別等比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn)(1)符合CCH診斷標(biāo)準(zhǔn)且臨床分級為Ⅱ級及以上的患者[7]；(2)屬于中醫(yī)肝腎陰虛型的CCH[5]，癥候表現(xiàn)為眼內(nèi)干澀不爽，白睛隱隱淡紅，雙目頻眨，羞明畏光，久視后則諸癥加重，伴口干少津，腰膝酸軟，頭暈耳鳴，夜寐多夢，舌紅，苔薄，脈細(xì)等諸癥；(3)觀察角膜、淚小點(diǎn)正常，淚道沖洗通暢。無淚囊炎及鼻淚管阻塞病變，無瞼內(nèi)外翻及倒睫；(4)無眼部手術(shù)史或3mo內(nèi)使用影響淚液分泌的藥物，無其他引起淚液學(xué)異常的全身性疾病；(5)自愿受試并簽署知情同意書。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn)(1)有瞼內(nèi)/外翻、倒睫、瞼緣炎、瞬目異?；驕I液蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼；(2)有青光眼或高眼壓病史；(3)有全身或眼部免疫性疾病患者，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干眼綜合征等；(4)妊娠或哺乳期婦女；(5)嚴(yán)重過敏體質(zhì)者；(6)嚴(yán)重糖尿病、心腦血管疾病、肝腎功能異常者。

1.1.3材料與儀器

1.1.3.1藥物杞精明目湯為枸杞子15g、黃精20g、麥冬20g、茯苓10g、炙甘草3g、旱蓮草15g、川芎3g構(gòu)成，由本院中藥房提供。人工淚液為3g/L玻璃酸鈉滴眼液。

1.1.3.2主要材料與儀器BQ 900裂隙燈(瑞士HAAG-STREIT公司)，熒光素鈉檢測試紙和淚液檢測濾紙條(天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司)，β-半乳糖苷酶染色試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，OCT包埋液(日本櫻花公司)，全自動(dòng)制冰機(jī)(江蘇格林電器有限公司)，O.C.T冰凍切片包埋機(jī)(日本Tissue-Tek公司)，倒置顯微鏡(德國Wilovert公司)。

1.2方法

1.2.1治療方法人工淚液組：3g/L玻璃酸鈉滴眼液常規(guī)點(diǎn)眼，每日3次，每次1滴，共使用3mo。聯(lián)合治療組：人工淚液局部點(diǎn)眼的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用杞精明目湯口服治療。杞精明目湯水煎每日1劑，共服用3mo。中藥炮制方法采用冷水浸泡，中到大火煎煮，分2次煎，分早晚2次服用。

表1 兩組CCH治療前后OSDI評分比較分)

組別n治療前治療3mo后tP人工淚液組407.13±2.767.83±3.091.6510.107聯(lián)合治療組407.00±1.849.25±3.027.809<0.001 t0.2392.087P0.8120.040

1.2.2觀察指標(biāo)對所有入選的CCH患者于治療前及治療3mo后隨訪。應(yīng)用國際眼表面疾病指數(shù)(ocular surface disease index，OSDI)評估眼部癥狀，積分越高則表示眼表癥狀嚴(yán)重程度越高[8]。裂隙燈檢查松弛結(jié)膜狀況、淚膜破裂時(shí)間(tear break-up time，BUT)評估淚膜穩(wěn)定性、基礎(chǔ)淚液分泌試驗(yàn)(Schirmer Ⅰ test，SⅠt)評估淚液分泌量。所有檢查均由同一人完成。

1.2.3手術(shù)方法對于臨床分級在Ⅲ級及以上、隨訪觀察3mo及以上、有手術(shù)意愿的兩組CCH患者，入院行松弛結(jié)膜新月形切除術(shù)。具體方法：開瞼器開瞼，手術(shù)顯微鏡下評估需切除的松弛結(jié)膜范圍，距角膜緣后5～6mm的下方球結(jié)膜按角膜緣弧度新月形切除松弛的結(jié)膜組織，10-0尼龍線縫合[9]。

1.2.4標(biāo)本處理及細(xì)胞衰老染色切除的松弛結(jié)膜組織置于O.C.T.包埋液中，-80℃冰箱凍存。冰凍組織塊切片加入適量的β-gal細(xì)胞衰老染色工作液，常溫孵育過夜，倒置顯微鏡下觀察并拍片記錄。

2結(jié)果

2.1 CCH治療前后OSDI評分兩組治療前OSDI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。人工淚液組治療3mo后較治療前OSDI顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.910,P<0.001)。聯(lián)合治療組治療3mo后較治療前OSDI顯著下降(t=18.976,P<0.001)。治療3mo后OSDI評分聯(lián)合治療組要明顯優(yōu)于人工淚液組(t=3.697,P<0.001)，見表1。

2.2 CCH治療前后BUT兩組治療前BUT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。人工淚液組治療3mo后與治療前BUT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.651,P=0.107)。聯(lián)合治療組治療3mo后BUT較治療前顯著延長(t=7.809,P<0.001)，且聯(lián)合治療組治療后的BUT顯著優(yōu)于人工淚液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.087,P=0.040)，見表2。

2.3 CCH患者治療前后SⅠt兩組治療前SⅠt差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。人工淚液組治療3mo后與治療前的SⅠt比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.971,P=0.338)。聯(lián)合治療組治療3mo后較治療前的SⅠt顯著增加(t=4.811,P<0.001)，且治療后的SⅠt聯(lián)合治療組顯著優(yōu)于人工淚液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.330,P=0.022)，見表3。

圖1 光鏡觀察細(xì)胞衰老染色，松弛結(jié)膜上皮細(xì)胞層染色各層清晰，β-gal染色衰老陽性細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色(箭頭標(biāo)注)，主要分布在結(jié)膜上皮層下(β-gal×200) A：聯(lián)合治療組，結(jié)膜上皮層相對較厚，上皮層下散在分布衰老染色陽性細(xì)胞；B：人工淚液組，結(jié)膜上皮層變薄，組織連接疏松，衰老染色陽性細(xì)胞較多。

組別n治療前治療3mo后tP人工淚液組407.03±3.307.28±2.810.9710.338聯(lián)合治療組407.40±3.368.95±3.574.811<0.001 t0.5042.330P0.6160.022

2.4 CCH患者細(xì)胞衰老染色治療3mo后采取結(jié)膜新月形切除術(shù)治療的CCH患者共11例11眼，其中人工淚液組7例7眼(18%)，年齡72.50±3.09歲；聯(lián)合治療組4例4眼(10%)，年齡71.07±2.27歲；兩組性別、年齡、眼別及CCH級別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可見人工淚液組的手術(shù)率明顯高于聯(lián)合治療組。對手術(shù)切除的松弛結(jié)膜組織行細(xì)胞衰老染色，發(fā)現(xiàn)兩組CCH患者松弛結(jié)膜組織中均出現(xiàn)β-gal細(xì)胞衰老染色陽性細(xì)胞，且主要分布于結(jié)膜上皮層下。其中人工淚液組衰老陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)為39.00±14.09個(gè)，顯著高于聯(lián)合治療組16.00±7.84個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.190，P=0.013，圖1)。

3討論

眼科醫(yī)師在日常工作中經(jīng)常會(huì)面對CCH患者，該病是門診常見但易誤診的眼表疾病之一。其診斷難點(diǎn)在于癥狀非特異性，起病隱蔽性[10]。輕中度患者癥狀輕微，可通過熱敷、按摩、理療和人工淚液治療。但嚴(yán)重病例保守治療無效，常采用手術(shù)。手術(shù)方法包括新月形松弛結(jié)膜切除術(shù)[9]、結(jié)膜鞏膜縫線固定術(shù)[11]及電凝治療術(shù)[12]等。但手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大且有一定適應(yīng)證，切除松弛結(jié)膜過少癥狀沒有改善，易復(fù)發(fā)；而切除過多可致結(jié)膜囊縮窄，甚至影響眼球轉(zhuǎn)動(dòng)。結(jié)膜鞏膜縫線固定術(shù)還可能穿破鞏膜壁，損傷脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜的風(fēng)險(xiǎn)。所以國內(nèi)外學(xué)者都在尋求一種安全、有效的治療手段[13]。

CCH的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，可能涉及不同的因素，如結(jié)膜老化、淚膜不穩(wěn)定、機(jī)械摩擦、眼表炎癥和淚液清除延遲[14]。近期研究通過基因測序和分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)CCH與細(xì)胞衰老相關(guān),且衰老相關(guān)因子p53/p21表達(dá)上調(diào)[2-3]。中醫(yī)經(jīng)典《銀海指南》中“白睛起膜，狀若魚泡，寒郁太陰也”與CCH所述癥狀與體征一致，表現(xiàn)為松弛的結(jié)膜堆積于瞼緣，導(dǎo)致眼表微環(huán)境失衡，淚液分泌和排泄異常，出現(xiàn)眼部異物感、淚溢、癢、澀、灼痛等，其屬于“白澀癥”“干澀昏花癥”“神水將枯”范疇?！吨T病源侯論》述“目澀癥”的病機(jī)為“目，肝之外侯也…其液竭者，則目澀”，《素問·逆調(diào)論》曰“腎者水臟，主津液”。當(dāng)肝腎不足則目外少潤澤之水，內(nèi)缺充養(yǎng)之液，雙目澀滯導(dǎo)致CCH。肝腎陰虛貫穿了CCH的發(fā)生發(fā)展過程，并影響本病的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸[5]。

結(jié)合CCH的中醫(yī)癥候和肝腎陰虛的特點(diǎn)，自擬中藥方劑杞精明目湯在臨床上取得了較好的治療效果[5-6]。方劑中枸杞子滋補(bǔ)肝腎、益精明目，提高機(jī)體免疫力、抗衰老、抗氧化，對肝陰虛、腎陰虛均有一定療效[15]；黃精滋陰潤肺、健脾益腎，可延緩衰老[16]；麥冬養(yǎng)陰潤肺，益胃生津，增強(qiáng)免疫功能及抗炎活性[17]；三者同為君藥。茯苓利水滲濕、可延緩衰老，增強(qiáng)免疫功能；炙甘草補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥，以助生化，兩者共為臣藥。旱蓮草滋補(bǔ)肝腎，對于肝腎陰虛體質(zhì)人群可增強(qiáng)機(jī)體免疫力、消除氧自由基和抗炎為佐藥。川芎活血化瘀、載藥上行為使藥，改善微循環(huán)、延緩腎臟病損[18]?？v觀全方補(bǔ)肝益腎、益氣養(yǎng)陰，兼具抗衰老、抗氧化之功效。本研究證實(shí)杞精明目湯聯(lián)合人工淚液治療組和人工淚液組均可降低CCH患者的OSDI評分(P<0.01)，緩解眼表不適癥狀，但杞精明目湯聯(lián)合治療要明顯優(yōu)于單純?nèi)斯I液治療(t=3.697,P<0.001)。聯(lián)合治療還可顯著延長CCH的淚膜破裂時(shí)間(t=7.809,P<0.001)，明顯改善淚液分泌(t=4.811,P<0.001)，而單純?nèi)斯I液點(diǎn)眼不能穩(wěn)定淚膜及改善淚液分泌(均P>0.05)。

細(xì)胞受到某些特定的刺激后，細(xì)胞的應(yīng)答程序被激活的現(xiàn)象被稱為細(xì)胞衰老。衰老的細(xì)胞通常會(huì)在形態(tài)學(xué)上發(fā)生特異性的變化，而β-gal則是目前為止能夠鑒別細(xì)胞衰老特異性最強(qiáng)的標(biāo)志[19]。因此在前期研究的基礎(chǔ)上[2-3]，本研究對CCH手術(shù)切除的松弛結(jié)膜組織行β-gal細(xì)胞衰老染色，發(fā)現(xiàn)兩組CCH松弛結(jié)膜組織上皮層下均出現(xiàn)衰老相關(guān)β-gal染色陽性細(xì)胞，其中單純?nèi)斯I液組的細(xì)胞衰老染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于杞精明目湯聯(lián)合人工淚液治療組(t=3.190，P=0.013)，再次證實(shí)CCH中確實(shí)存在細(xì)胞衰老，而杞精明目湯從一定程度上可延緩衰老，從而發(fā)揮治療作用。通過聯(lián)合應(yīng)用中藥杞精明目湯治療后，CCH患者癥狀、體征均明顯改善，因此需要手術(shù)的患者減少，從而避免了手術(shù)帶來的風(fēng)險(xiǎn)，可以作為一種安全、有效的替代治療方案，但是還需要長期的隨訪觀察。

關(guān)于杞精明目湯延緩細(xì)胞衰老的分子機(jī)制，既往研究發(fā)現(xiàn)杞精明目湯含藥血清可下調(diào)CCH成纖維細(xì)胞中MAPK信號通路相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，尤其是抑制p38 MAPK蛋白的磷酸化水平和基因表達(dá)[20]。已知p38 MAPK信號通路是MAPK家族中的重要組成部分，調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、衰老和凋亡；p38 MAPK可上調(diào)衰老相關(guān)因子p53/p21的表達(dá)，介導(dǎo)CCH成纖維細(xì)胞的衰老過程[2]。同時(shí)CCH中的熱休克蛋白、滲透壓改變、白介素1和腫瘤壞死因子α等細(xì)胞因子激活p38 MAPK信號通路，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[21]；氧化應(yīng)激損傷又反過來激活p38 MAPK信號通路，加速其下游衰老相關(guān)因子的表達(dá)，不斷惡性循環(huán)最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老[22]。而杞精明目湯中含有多味抗衰老的中藥成分，本方主要成分之一枸杞的提取物可明顯緩解鼠模型的干眼癥狀[23]；枸杞中主要成分枸杞多糖可以降低p53、p21、Bax等衰老基因的表達(dá)，同時(shí)增加端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性[24]。黃精亦可增強(qiáng)端粒酶活性、對抗自由基損傷，增強(qiáng)免疫能力來延緩衰老[25]。推測杞精明目湯可能通過抑制p38 MAPK/p53/p21信號通路，延緩CCH細(xì)胞衰老從而發(fā)揮治療作用，其具體機(jī)制尚需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，杞精明目湯聯(lián)合人工淚液治療CCH可顯著改善臨床癥狀，維護(hù)淚膜穩(wěn)定性，改善淚液分泌及減少細(xì)胞衰老的產(chǎn)生，其療效較之單純?nèi)斯I液治療更為有效，可作為除手術(shù)治療之外的安全、有效的替代治療方案。