周義玲，張 昱，紀巧榮，寇 娜，穆罕默德·杰馬，袁周陽，劉 杰，韓 瑩，申香群，張 偉，3△

(1.青海大學醫(yī)學院，中國 西寧 810001；2.浙江省臺州醫(yī)院，中國 臺州 318000；3.青海省高原醫(yī)學應(yīng)用基礎(chǔ)重點實驗室，中國 西寧 810001)

高原低氧是否會對腸道黏膜免疫系統(tǒng)在抵御外源性微生物過程中產(chǎn)生影響尚不明確。本研究以十二指腸感染了鼠多形螺旋線蟲Heligmosomoidespolygyrus(H.polygyrus，Hp)和腸道鼠枸櫞酸桿菌Citrobacterrodentium(C.rodentium，Cr)的小鼠為模型，探討低氧對蠕蟲和細菌混合感染小鼠腸道黏膜免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡SPF級BALB/c雌鼠30只，體重(18±2)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。動物的使用和處理經(jīng)過青海大學醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組與造模

小鼠飼養(yǎng)于溫度為(20±2)℃、相對濕度為(40±5)%的IVC鼠籠中，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為6組：常氧對照組(Control組。青海西寧，海拔2 260m：大氣壓582mmHg，PO2121.6mmHg)、低氧對照組(H-Control組。低壓艙：海拔5 000m，大氣壓405mmHg，PO284.7mmHg)、常氧H.polygyrus感染組(Hp組)、低氧H.polygyrus感染組(H-Hp組)、常氧H.polygyrus和C.rodentium混合感染組(Hp+Cr組)、低氧H.polygyrus和C.rodentium混合感染組(H-Hp+Cr組)，每組5只。首先將Hp+Cr組和H-Hp+Cr組感染H.polygyrus(L3期幼蟲200條/只)，1周后再感染C.rodentium(2.5×109CFU/只)，感染(C.rodentium)兩周后開腹(無菌)取材。為了保證造模條件的一致性，其余四組的處理時間均為第3周最后一天。在造模期間稱量小鼠體重以觀察其在低氧和感染條件下的體重變化。

1.2.2H.polygyrus和C.rodentium活化

鏡下觀察顯示4 ℃下儲存的L3期H.polygyrus幼蟲活動度良好，計數(shù)H.polygyrus幼蟲并經(jīng)口感染小鼠(L3期幼蟲200條/只)，感染3周后取材并收集小鼠糞便培養(yǎng)，培養(yǎng)1周后收集新的L3期H.polygyrus幼蟲于試管中并保存于4 ℃冷藏柜備用。Hp+Cr組和H-Hp+Cr組感染H.polygyrus一周后再感染C.rodentium。首先在C.rodentium(strain DBS100；ATCC number 51459)凍干粉中加入無菌水，復溶后取菌液在麥康凱瓊脂平板上進行培養(yǎng)(37℃，過夜)，其余菌液分裝凍存于-80 ℃冰箱，次日取一個菌落在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌液變渾濁后檢測其吸光度值并計算相應(yīng)的濃度及體積。

1.2.3 實驗動物取材

將小鼠用CO2麻醉后于心臟取血，靜置2 h后離心(3381g)10 min，收集血清備用；用75%酒精消毒后開腹，取出小腸測量其長度；取十二指腸上段沿縱切面剖開，鏡下分檢H.polygyrus并計數(shù)；截取0.5 cm十二指腸行OCT包埋做常規(guī)冰凍切片。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法檢測血清中IgE、IgG1抗體濃度。

1.3 實驗試劑

抗小鼠1stAb、標準品和抗小鼠2ndAb(IgE、IgG1)均購自美國BD公司；辣根過氧化物酶、TMB顯色液及濃硫酸購自上海玉博生物科技有限公司；OCT購自美國Sakura Finetek公司；HE染料購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠外在表現(xiàn)

Control組和Hp組整體表現(xiàn)良好，無明顯異常。Hp+Cr組小鼠在感染細菌5～7天后，狀態(tài)萎靡、便稀軟、脊柱隆起、毛發(fā)枯燥，有輕微的便血；H-Hp+Cr組各項癥狀出現(xiàn)較早，且明顯為重。

2.2 小鼠體重

小鼠體重變化見圖1。重復測量分析小鼠體重變化：各組小鼠體重變化符合線性關(guān)系，F(xiàn)=154.971，P<0.01，兩兩比較采用LSD檢驗，Hp+Cr組和H-Hp+Cr組小鼠體重均低于相應(yīng)的單純感染組(P<0.05)，Hp組與Control組比，小鼠體重無明顯變化，而合并C.rodentium感染時，體重明顯降低(P<0.05)，提示單純H.polygyrus感染對小鼠體重無明顯影響；各低氧組小鼠體重均低于常氧組(P<0.05)，其中以H-Hp+Cr組小鼠體重降低最為明顯，顯示低氧處理會使小鼠體重降低。

圖1 小鼠體重變化量圖

Figure 1 Changes Mice Body weight

2.3 小鼠小腸長度

小鼠小腸長度見表1。結(jié)果顯示：與Control組相比，Hp組和Hp+Cr組的小腸明顯增長(P<0.05)。Hp組與Hp+Cr組比較無顯著性差異。與H-Control組相比，H-Hp組和H-Hp+Cr組小腸均增長(P<0.05)。各低氧組小腸長度均長于相應(yīng)的常氧組(P<0.05)，提示低氧條件會使小腸長度增長。

表1 小鼠小腸長度

*：與Control組比較，P<0.05；#：與Hp組比較，P<0.05；◆：與Hp+Cr組比較，P<0.05；●：與H-Control組比較，P<0.05

2.4 小鼠十二指腸H.polygyrus數(shù)目

十二指腸H.polygyrus數(shù)目見表2。與Hp組比較，Hp+Cr組H.polygyrus數(shù)目明顯增多，有顯著性差異(P<0.05)；H-Hp+Cr組H.polygyrus數(shù)目較H-Hp組多(P<0.05)；各低氧感染組H.polygyrus數(shù)目明顯多于相應(yīng)的常氧組(P<0.05)。其中，H-Hp+Cr組H.polygyrus數(shù)目最多。

表2 小鼠十二指腸H.polygyrus的數(shù)目

GroupnThenumberofH.polygyrusHp580.6±8.1H-Hp5114.0±11.7#Hp+C595.2±9.8#H-Hp+Cr5142.5±13.3◆■F- 27.284P- 0.000

#：與Hp組比較，P<0.05；◆：與Hp+Cr組比較，P<0.05；■：與H-Hp組比較，P<0.05

2.5 小鼠血清抗體濃度

血清抗體濃度見表3。與Control組相比，Hp組和Hp+Cr組血清IgE、IgG1濃度均明顯升高(P<0.05)，其中Hp+Cr組IgE濃度高于Hp組(P<0.05)，而IgG1則相反。與H-Control組相比，H-Hp組和H-Hp+Cr組血清IgE濃度均明顯升高(P<0.05)，且H-Hp+Cr組IgE濃度高于H-Hp組，有顯著性差異(P<0.05)；與H-Control組相比，H-Hp組IgG1濃度明顯升高(P<0.05)，H-Hp+Cr組IgG1濃度無明顯變化，且H-Hp+Cr組IgG1濃度低于H-Hp組。H-Hp組和H-Hp+Cr組IgE濃度明顯低于相應(yīng)的常氧組；低氧H-Hp+Cr組IgG1濃度低于Hp+Cr組。

表3 小鼠血清免疫球蛋白含量

Table 3 The concentration of serum immunoglobulin in mice

*：與Control組比較，P<0.05；#：與Hp組比較，P<0.05；△：與Cr組比較，P<0.05；◆：與Hp+Cr組比較，P<0.05；●：與H-Control組比較，P<0.05；■：與H-Hp組比較，P<0.05；★：與H-Cr組比較，P<0.05

2.6 小鼠十二指腸形態(tài)

十二指腸形態(tài)學變化見圖2。Control組十二指腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜基本完好，肌層厚薄均勻；H-Control組表現(xiàn)為輕微黏膜破損，與Control組比無明顯差異；Hp組、H-Hp組、Hp+Cr組和H-Hp+Cr組均有不同程度的形態(tài)學改變，H-Hp+Cr組尤為明顯，十二指腸組織結(jié)構(gòu)完整性破壞明顯，黏膜破損嚴重，上皮大量脫落，并伴有明顯的炎細胞浸潤至固有層和肌層。

A：Control組，十二指腸組織結(jié)構(gòu)基本完整，肌層厚薄均勻；B：H-control組，有輕微的黏膜破損；C：Hp組，黏膜破損較Control組明顯，有炎細胞浸潤；D：H-Hp組，破損較Hp組明顯；E：Hp+Cr組，有明顯的上皮脫落和炎細胞浸潤；F：H-Hp+Cr組，破壞最嚴重，有大量的上皮脫落及炎細胞浸潤至固有層和肌層

圖2 小鼠十二指腸形態(tài)變化圖(HE staining，×200)

Figure 2 Morphological changes of duodenum in mice(HE staining，×200)

3 討論

腸道黏膜是機體免疫系統(tǒng)最大也是最為復雜的部分[1]，作為阻止腸道病原菌入侵的第一道防線，對于維持機體健康起著至關(guān)重要的作用。當機體受到寄生蟲、細菌等外界病原體入侵時[例如像導致嚴重嬰幼兒腹瀉的腸致病性大腸桿菌(Entero-pathogrnicEscherichiacoli，EPEC)感染[2]]，腸道黏膜免疫系統(tǒng)就會發(fā)揮相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)機制來保護機體免受傷害。H.polygyrus是一種自然源性的嚙齒類動物腸道線蟲[3]，主要寄生于小鼠十二指腸。當感染H.polygyrus時，宿主就會產(chǎn)生以Th2型免疫反應(yīng)為主的免疫功能來預防和清除寄生蟲。青藏高原常見的細粒棘球絳蟲，其幼蟲寄生于人或家畜，為人獸共患病，稱為包蟲病。主要流行于我國西北牧區(qū)，其幼蟲進入機體后也可刺激機體產(chǎn)生Th1、Th2免疫反應(yīng)，其誘導的Th2型免疫反應(yīng)為主導反應(yīng)[4]。因此，研究H.polygyrus感染的免疫學機制，可為早期預防和診斷高原包蟲病提供理論基礎(chǔ)。C.rodentium是一種定植在結(jié)腸末端的革蘭陰性桿菌，是小鼠特異性的細菌病原體，有研究表明其編碼黏附功能的基因與EPEC具有功能同源性[5]，因此很適合研究EPEC的發(fā)病機制。

本研究記錄了整個小鼠疾病過程中體重的動態(tài)變化。結(jié)果顯示，各低氧組體重均低于常氧組，提示在高海拔低氧狀態(tài)下，機體由于應(yīng)激反應(yīng)，使腸道缺血缺氧加重[6]，從而抑制胃腸運動，導致食欲減退。另外，低氧混合感染組體重明顯低于低氧蠕蟲感染組和低氧對照組，說明在低氧條件下，蠕蟲合并細菌感染時，加重了對消化功能的影響，最終引起體重減輕。

研究結(jié)果顯示，常氧和低氧條件下蠕蟲感染組和混合感染組小鼠小腸長度均增長。本實驗團隊前期的研究結(jié)果也表明蠕蟲感染時小腸長度增長可能與肥大細胞活化脫顆粒及分泌型上皮細胞增多有關(guān)；各低氧組小腸長度明顯長于相應(yīng)的常氧組，是由于缺氧會引起胃腸道反應(yīng)性減弱、胃腸平滑肌舒張。鏡下分檢H.polygyrus并計數(shù)發(fā)現(xiàn)，各混合感染組H.polygyrus數(shù)目明顯多于單純?nèi)湎x感染組，提示合并C.rodentium感染時，C.rodentium會影響機體對H.polygyrus的排除；各低氧感染組H.polygyrus數(shù)目明顯多于常氧感染組，可能是由于低氧條件引起腸黏膜缺血、缺氧加重、小腸蠕動減弱等導致機體對H.polygyrus的清除能力減弱。

IgE是一種由黏膜下淋巴組織中的漿細胞分泌的免疫球蛋白，在腸道黏膜免疫系統(tǒng)的形成及抵抗病原體入侵中起著越來越重要的作用[7]，近年來，有研究[8，9]表明，IgE在腸道寄生蟲感染者血清中的含量顯著升高。本實驗結(jié)果顯示，在常氧和低氧條件下單純?nèi)湎x感染組和混合感染組血清中IgE的濃度明顯升高，而混合感染組IgE的濃度明顯高于蠕蟲感染組，可能與C.rodentium感染影響H.polygyrus數(shù)目增多有關(guān)。另外，Th2型細胞因子白介素-4(IL-4)可通過多種途徑活化B細胞，誘導IgE合成，使血清中IgE的水平升高[10]，本實驗團隊尚未發(fā)表的研究結(jié)果顯示，混合感染組腸系膜淋巴結(jié)細胞分泌IL-4水平升高，這可能也是混合感染組IgE濃度明顯升高的原因。

IgG是血清和細胞外液中含量最高的免疫球蛋白，是全身性體液免疫的主要效應(yīng)分子，在機體抗感染免疫中起著重要作用。有研究[11]表明，寄生蟲感染時伴有高水平的IgG1，本實驗結(jié)果也顯示在常氧和低氧條件下各感染組的IgG1水平明顯升高，但混合感染組IgG1水平則低于單純?nèi)湎x感染組，提示C.rodentium也會影響H.polygyrus誘導的Th2型免疫反應(yīng)。各低氧感染組IgE的濃度均明顯低于各常氧感染組，IgG1的濃度與相應(yīng)的常氧感染組相比也有下降趨勢，提示低氧會影響IgE、IgG1的產(chǎn)生。SaiRam M等研究[12]表明，低氧下免疫球蛋白濃度明顯降低，與本實驗結(jié)果一致。

綜上所述，本研究通過模擬低氧條件下腸道蠕蟲和細菌混合感染模型，研究低氧對混合感染小鼠腸道黏膜免疫功能的影響。結(jié)果顯示，低氧暴露會損傷腸黏膜且使血清IgE、IgG1抗體濃度降低，影響腸道黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮其免疫功能，加重H.polygyrus和C.rodentium導致的腸道損傷。機體的免疫應(yīng)答包括先天性免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，后者又包括主要由T細胞參與的細胞免疫應(yīng)答，以及B細胞所介導的體液免疫應(yīng)答。本實驗中我們主要對低氧條件下體液免疫應(yīng)答的改變進行了簡單分析，還應(yīng)進行高海拔低氧暴露對機體固有免疫應(yīng)答和特異性細胞免疫應(yīng)答影響的相關(guān)研究，包括T細胞分泌細胞因子的檢測，本實驗團隊正在做相關(guān)的實驗研究；對于參與腸道黏膜免疫系統(tǒng)的各項信號通路的檢測也極其重要，本實驗團隊正在做相關(guān)計劃，以完善有關(guān)高原低氧對腸道黏膜免疫系統(tǒng)影響的研究。