馬 美，蘇占海，王海燕

(青海大學醫(yī)學院)

乳腺癌中內(nèi)分泌依賴性乳腺癌、HER2陽性乳腺癌的抗腫瘤藥物研究進展順利，而三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)因其組織學分級高，較其他乳腺癌亞型更具侵襲性而缺乏有效治療藥物。

余甘子為大戟科葉下珠屬植物(Phyllanthus emblica L)，主治癌癥等，是一味重要的傳統(tǒng)藏藥[1]，1990年首次載入《中國藥典》。既往研究表明，余甘子鞣質(zhì)類成分柯里拉京對人鼻咽癌細胞KB、卵巢癌細胞A2780、骨肉瘤細胞OS-732、結(jié)腸癌細胞HCT-8、人肺腺癌細胞A549等有顯著的生長抑制作用[2]。余甘子[3]葉總黃酮對肝癌細胞株Bel-7404、HepG-2，人宮頸癌細胞株Hela，人胃癌細胞株SGC7901，人鼻咽癌細胞株CNE-2，人肺癌細胞株H460，人卵巢癌細胞株A2780等均有良好的生長抑制作用。余甘子提取物對人肺癌細胞A549、肝癌細胞 HepG2 具有抑制作用。余甘子水提物呈劑量依賴性抑制體外培養(yǎng)的L929細胞的生長。

因此，本研究以人乳腺癌MDA-MB-231細胞為體外模型，研究藏藥余甘子對MDA-MB-231細胞增殖的影響，并從基因水平探討其對細胞周期蛋白CyclinG2、細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p21表達的影響，分析三陰性乳腺癌病人CyclinG2、p21的表達與預后情況，為藏藥余甘子的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物

余甘子的干燥果實(購于安徽亳州中藥材交易中心，產(chǎn)地江西，取樣量300g，合格證批號191104)。

1.1.2 細胞株

人乳腺癌MDA-MB-231 細胞(來自北京協(xié)和醫(yī)科大學細胞庫)。

1.1.3 試劑與儀器

MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(索萊寶，中國)；Trizol、RNAiso Plus、組織/細胞總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶日醫(yī)，中國)；細胞周期與凋亡檢測試劑盒(碧云天，中國)。

旋蒸儀(EYELA，日本)、細胞培養(yǎng)箱(Forma，美國)、超凈工作臺(Thermo，美國)、酶標儀xMark-10483(Bio-rad，日本)、純水儀(默克密理博，德國)、LightCycler OR 96 全自動熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)、低溫冷凍離心機(Eppendrof，德國)、瓊脂糖凝膠電泳成像儀(Azure biosystem，美國)、CKX4型倒置顯微鏡(Olympus，日本)、Nanodrop 2000型超微量分光光度計(Thermo，美國)、流式細胞儀(BECKMAN，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 浸膏制備

取300 g余甘子粉碎，用90%乙醇回流提取3次，每次3 h。將提取液蒸發(fā)后得浸膏。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及分組

在顯微鏡下觀察細胞貼壁生長情況。當富集度達80%時按 1：2的比例傳代，后續(xù)實驗均采用3代以后貼壁80%的細胞株。分組參照文獻[4]分為對照組、實驗組。

1.2.3 細胞抑制率檢測

將對數(shù)期細胞(富集度達80%)鋪于96孔板上，每孔加1×105個細胞，每組細胞設(shè)置6個平行復孔，置細胞培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板，去除上清液。對照組加入100 μL新鮮完全培養(yǎng)基，實驗組加入100 μL不等濃度余甘子(320、160、80、40、20μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再次去除上清液，每孔加入10 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h。然后吸去上清液，每孔加110 μL Formazan溶解液，低速晃動10 min，用酶標儀在 490 nm波長處測光密度(OD)值，根據(jù)OD值繪制細胞增殖曲線。實驗重復3次。

1.2.4 細胞周期檢測

取生長對數(shù)期的細胞，消化后吹打成單細胞，均勻鋪于6孔板上；待80%細胞貼壁后，換無血清培養(yǎng)基做饑餓處置(24h)；對照組(培養(yǎng)基中含0.1% DMSO)、實驗組均設(shè)三個復孔；培養(yǎng)時間結(jié)束時收集原培養(yǎng)液，用胰酶細胞消化液消化細胞，至細胞變圓后，棄胰酶細胞消化液，終止消化；重懸細胞后再次離心沉淀細胞；加入300 μL預冷的PBS重懸細胞(動作輕柔)，再逐滴緩慢加入700 μL預冷的乙醇中，輕輕吹打混勻，固定24 h(4℃)；離心去除上清液；加入1 mL預冷的PBS重懸細胞，再次離心去除上清液后加入0.5 mL配置好的碘化丙啶染色液，避光水浴(37℃，30min)；上流式細胞儀檢測。

1.2.5CyclinG2，p21表達檢測

取對數(shù)生長期(富集度達80%)的MDA-MB-231細胞，用1×PBS緩沖液洗滌細胞2次，加入1 mL 0.25%胰酶-EDTA消化液，消化3 min左右，加入1 mL完全培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打細胞使其均勻懸浮。按 1×105個細胞/孔的密度，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，置CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、1% O2)中培養(yǎng)(過夜)。第2日按照實驗分組更換含藥培養(yǎng)基：對照組加入200 μL新鮮完全培養(yǎng)基，實驗組加入200 μL余甘子藥液(c=20μg/mL)，每組設(shè)3個復孔，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng) 24 h 后用PBS清洗2次，加入Trizol 裂解，按照總RNA提取試劑盒的操作說明提取各組細胞的總RNA。測定RNA濃度及純度(A260/280在1.8～2.0之間提示RNA的純度較高)。同時，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。將純度較高、完整性良好的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需要取出相應(yīng)所需量的總RNA立即進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：37 ℃，15 min×3；85 ℃，5 sec；4 ℃，1 min。設(shè)計和合成PCR的引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s。共 40個循環(huán)。每個樣品重復3次，反應(yīng)結(jié)束后確認Rtime PCR的擴增曲線和溶解曲線，用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表1 引物與內(nèi)參序列

Table 1 Sequence of primers and internal parameters

1.2.6 三陰性乳腺癌患者中CyclinG2和p21的表達與預后分析

利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析239例三陰性乳腺癌患者CyclinG2的p21 RNA數(shù)據(jù)與預后情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 22.0和Grapad Prism 7.0統(tǒng)計軟件處理，均數(shù)之間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 余甘子對乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖的影響

與對照組比較，余甘子組(320、160、80、40、20μg/mL)細胞活性明顯降低(P<0.05)，呈濃度依賴效應(yīng)。依據(jù)MTT實驗結(jié)果，計算余甘子對MDA-MB-231的IC50(26.65μg/mL)，見圖1。選取20 μg/mL的余甘子行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度作用后的抑制率(%)圖

Figure 1 Inhibition rate detected by MTT after different concentrations(%)

2.2 余甘子對細胞周期的影響

有關(guān)研究表明，余甘子鞣質(zhì)部位能夠顯著抑制人纖維肉瘤細胞HT1080的遷移和侵襲[4]。陳靜等[5]發(fā)現(xiàn)余甘子鞣質(zhì)部位對人腫瘤細胞 A549、BEL-7402的抑制作用機制，可能與誘導腫瘤細胞凋亡及細胞G2/M 期阻滯有關(guān)。余甘子使癌細胞發(fā)生S期阻滯，影響細胞周期正常進程，與細胞凋亡有關(guān)。本實驗為了確定余甘子對MDA-MB-231細胞的細胞周期的影響，通過流式細胞術(shù)分析了余甘子處理細胞24 h后細胞周期的變化，見圖2。

圖2 余甘子(20μg/mL)對MDA-MB-231細胞周期的影響圖

2.3 余甘子對CyclinG2和p21表達的影響

為了探索余甘子抑制人乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞增殖的機制，課題組采用qPCR法檢測CyclinG2、p21的表達水平，與對照組(DMSO組)相比，余甘子(20μg/mL)作用后的CyclinG2、p21在 MDA-MB-231 細胞系中表達顯著增高(P<0.05)，見圖3。

圖3 余甘子(20μg/mL)作用后人乳腺細胞內(nèi)CyclinG2、p21表達水平圖

Figure 3 Effects of Yuganzi(20μg/mL)on the expression levels ofCyclinG2 andp21 in mammary gland cells

2.4 對三陰性乳腺癌患者CyclinG2和p21的表達與預后的分析

前述體外試驗顯示余甘子處理MDA-MB-231細胞后，CyclinG2、p21表達水平顯著增高。這兩個基因的表達量增高和患者的預后具有相關(guān)性，我們通過KMplot分析了239例臨床三陰性乳腺癌患者CyclinG2、p21的mRNA數(shù)據(jù)與預后情況，見圖4。高表達CyclinG2基因的患者與低表達的患者相比預后良好，具有顯著性差異(P=0.0037)。高表達P21基因的患者與低表達的患者相比預后沒有顯著性差異(P=0.77)，但從總預后概率曲線圖中仍能看出，高表達p21基因的患者預后較低表達者好。

圖4CyclinG2、p21基因表達水平與三陰性乳腺癌患者的預后關(guān)系圖

Figure 4 Relationship betweenCyclinG2 andp21 gene expression level and prognosis of triple negative breast cancer patients

3 討論

余甘子抗腫瘤作用研究備受關(guān)注，關(guān)于其提取物及相關(guān)成分的抗腫瘤研究較多，從細胞水平的研究較少且結(jié)論不同。無限增殖是腫瘤的最大特點，細胞周期紊亂是最直接原因，細胞周期調(diào)控是細胞增殖調(diào)節(jié)的核心環(huán)節(jié)。文獻總結(jié)提示：細胞增殖與凋亡的雙重假說在腫瘤形成中起主要作用；細胞周期的調(diào)控與細胞死亡有關(guān)，在腫瘤發(fā)生過程中意義重大。目前已確認，細胞周期調(diào)控的主要分子基礎(chǔ)是周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶復合體的相互作用。凋亡缺陷是促進腫瘤發(fā)生、誘導腫瘤治療失敗的主要原因。本研究結(jié)果顯示，與對照組的MDA-MB-231細胞比較，余甘子作用后的G1/S期細胞比例增加。因此得出，余甘子將細胞周期阻滯在G1/S期，促進了三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的凋亡。

細胞周期蛋白是指與真核細胞的細胞周期呈同步周期性濃度升降的蛋白質(zhì)，最先是從海膽胚胎中分離出的，為相對分子質(zhì)量為50 000蛋白質(zhì)家族的一員。它們與關(guān)鍵的蛋白質(zhì)激酶(細胞周期蛋白依賴性激酶，CycinG2-dependent kinases，CDKs)結(jié)合，并調(diào)節(jié)它們的酶活性，推動和協(xié)調(diào)細胞周期。G型蛋白是細胞周期蛋白家族中的新成員，它的結(jié)構(gòu)比較特殊：N端缺少降解所需的“destruction box”氨基酸序列，而C端卻包含有與表皮生長因子受體相似的自主磷酸化位點，這表明它既是一種細胞周期蛋白，也是細胞內(nèi)的信號傳導因子。并且CyclinG2的C末端存在一個由46個氨基酸組成的擴展區(qū)，其中包括PEST(Prototypic protein destabilizing sequences，原型蛋白不穩(wěn)定序列)結(jié)構(gòu)域，在CycinG2的第272～294位氨基酸區(qū)表現(xiàn)得更為明顯，包含一個新近發(fā)現(xiàn)的序列結(jié)構(gòu)域N-X-X-Y，它是信號蛋白shcPTB結(jié)合的潛在位點。CyclinG2主要在細胞質(zhì)中，與裂殖酵母的cig2及出芽酵母的clb5具有更高的同源性。它的表達隨細胞周期時相不同而發(fā)生波動，在S中期達高峰。目前研究均提示它可能作為負調(diào)因子參與細胞增殖調(diào)節(jié)：CyclinG2高表達對HeLa細胞的體外增殖和生長有顯著抑制作用[6]。在腎透明細胞中，CyclinG2表達較低，其表達率高可抑制腫瘤的發(fā)生。CyclinG2高表達可顯著抑制體外培養(yǎng)胃癌細胞SGC-7901的增殖[7]。CyclinG2表達水平的降低和甲狀腺乳頭狀腺癌的惡變關(guān)系緊密[8]。在惡性口腔角化細胞和口腔癌上皮細胞中，CyclinG2表達顯著下降[9]。本研究中，高表達CyclinG2的人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231在體外增殖活性下降，提示其在胃癌細胞周期調(diào)控中發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用，具體影響機制有待進一步探討。

長鏈非編碼RNA p21是p53最重要的下游基因之一[10]，而p53是參與維持基因組完整性的重要腫瘤抑制基因，所以p21可以和p53共同構(gòu)成細胞周期G1檢查站，即DNA損傷后不經(jīng)過修復則無法通過，減少了受損DNA的復制和積累，從而發(fā)揮抑癌作用[11]。細胞周期素(Cyclin)、細胞周期素依賴性激酶(CDKs)、細胞周期依賴性激酶抑制因子(CDKIs)是參與細胞周期調(diào)節(jié)的三大元素。其中CDKs促進細胞增殖，而CDKIs抑制細胞增殖。p21是CDKIs家族中的重要成員。負性調(diào)節(jié)因子p21蛋白缺乏可導致細胞周期正負調(diào)節(jié)因子失衡，出現(xiàn)細胞周期紊亂[12]，最終導致腫瘤的發(fā)生[13]。p21介導的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵途徑：正常肝臟組織p21表達明顯高于肝癌組織，p21是p53的一個主要靶點，在檢測到DNA損傷時，它與細胞周期阻滯(調(diào)節(jié)G1期向S期的過渡)有關(guān)[14]。胃癌組織p21水平明顯降低，低水平p21與胃腫瘤侵襲情況及TNM分期相關(guān)[15]。p21在彌漫性大B細胞淋巴瘤組織和細胞系中表達均下調(diào)，可用于區(qū)分彌漫性大B細胞淋巴瘤和正常組織[16]。SAHA通過調(diào)控p21啟動子乙酰化水平阻滯細胞周期S期，影響乳腺癌 MCF-7 細胞周期[17]。p21直接抑制細胞周期G1/S期來抑制CDK2、CDK4、CDK6的激酶活性[18]。p21激活激酶 4(PAK4)與乳腺癌的非停泊性生長、存活、轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。最近的研究顯示辣椒堿干預可明顯上調(diào)p21表達，抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖[20]。與此一致的是本研究結(jié)果顯示，余甘子呈濃度依賴性上調(diào)p21，提示余甘子抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的分子機制可能與上調(diào)p21有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，余甘子可抑制MDA-MB-231細胞體外增殖，將細胞周期阻滯在G1/S期，從而促進三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的凋亡，其機制可能與上調(diào)CyclinG2和p21 mRNA 水平有關(guān)，高表達CyclinG2、p21基因的患者與低表達的患者相比預后較好。

本研究的結(jié)論是在細胞水平上得出的，并未結(jié)合余甘子干預后的病例資料分析。