仁增加，切羊讓忠，2，華吉卓瑪，貢卻堅(jiān)贊，2※

(1.青海大學(xué)藏醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810016；2.藏藥新藥開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；3.海西州蒙藏醫(yī)醫(yī)院，青海 德令哈 817000)

大黃為寥科植物掌葉大黃palmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim，exBalf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖，是中藏藥常用的藥材?，F(xiàn)代研究表明，大黃成分主要包括蒽醌類(lèi)衍生物、蒽酮類(lèi)衍生物和二苯乙烯類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、?；擒疹?lèi)、色酮類(lèi)、苯丁酮苷類(lèi)等各類(lèi)型化合物，具有瀉下、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、保肝利膽、降血脂、改善腎功能等藥理作用。近幾年，有關(guān)大黃抑制炎癥發(fā)生發(fā)展的研究報(bào)道較多[4]，但從細(xì)胞和分子層面揭示大黃抗炎作用機(jī)制的研究甚少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對(duì)藥物的有效成分進(jìn)行多靶點(diǎn)、多途徑生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)圖分析的學(xué)科。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)大黃有效成分的抗炎關(guān)鍵靶點(diǎn)、功能、通路進(jìn)行分析，揭示其抗炎作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分查找與主要活性成分篩選

本文采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索大黃的所有化學(xué)成分，共查找了92個(gè)化合物。通過(guò)評(píng)價(jià)成分的體內(nèi)過(guò)程，以口服生物利用度(oralbioavailability，OB)≥30%和類(lèi)藥性(drug-like，DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選中藥的活性成分[1]。其中OB值是評(píng)價(jià)藥物能否發(fā)揮藥效的重要指標(biāo)，DL值代表成分與已知化學(xué)藥的相似性，這兩個(gè)值對(duì)確定中藥成分是否對(duì)機(jī)體產(chǎn)生活性具有重要參考價(jià)值[2]。

1.2 活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息獲取

根據(jù)篩選出來(lái)的活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與之相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，并進(jìn)一步使用R軟件將其靶點(diǎn)數(shù)據(jù)在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因注釋及確認(rèn)。運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件(http：//www.Cytoscape.org/)構(gòu)建大黃化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 疾病靶點(diǎn)的收集與整理

以inflammation、inflammatory為檢索詞，在人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)Genecards(https：//www.genecards.org/)、人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM(https：//omim.org/)檢索與之相關(guān)的靶點(diǎn)，將Relevance score設(shè)為大于5，且應(yīng)用Venny 2.1.0在線軟件篩選大黃和炎癥的交集靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建與分析

將大黃和炎癥的交集靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)，物種選為Homo sapiens，最低要求的評(píng)分條件設(shè)定為中等置信度0.4，通過(guò)高級(jí)設(shè)置隱藏網(wǎng)絡(luò)圖中游離的蛋白質(zhì)，其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)，再將TSV文本數(shù)據(jù)導(dǎo)入cytoscape 3.7.2軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

將獲取的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置參數(shù)如下，物種選“H.sapinens”；Min Overlap：3，P Value：0.01，Min Enrichment：1.5；GO生物功能選GO Molecular Functions、GO Biological Processes、GO Cellular Components，Pathway選Canonical Pathways、Reactome Gene Sets、KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)。然后進(jìn)行GO生物功能和KEGG通路富集分析，并運(yùn)用KEGG mapper工具繪制主要通路的通路圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃活性成分分析

在TCMSP中將OB≥30%、DL≥0.18設(shè)為篩選條件，并補(bǔ)充常用組分，剔除非人員靶標(biāo)，最終獲得7個(gè)有效活性成分，詳見(jiàn)表1。我們發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素具有很高的口服利用度，而β-谷甾醇具有很高的類(lèi)藥性。

2.2 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到與大黃活性成分相對(duì)應(yīng)的靶基因74個(gè)，并使用Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行注釋及確認(rèn)，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件將大黃的7個(gè)化合物和74個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。圖中內(nèi)圈為化合物，中圈(degree=1)和外圈(degree≧2)為靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)大小表示度值的大小。其中beta-sitosterol(degree=26)、aloe-emodin(degree=19)是化合物中度值最高的，靶點(diǎn)NCOA2和PTGS2的度值為6，度值越大，表明其抗炎的貢獻(xiàn)越高。

表1 大黃的活性成分及OB和DL值

Table 1 The Active Ingredients of Rhubarb and the values of OB&DL

圖1 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

Figure 1 The Network Diagram of Compound-Target Spot

2.3 大黃與炎癥的交集基因計(jì)算

從Genecards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與炎癥相關(guān)的所有靶點(diǎn)，設(shè)置篩選條件，相關(guān)性得分大于5后得1 208個(gè)靶點(diǎn)，運(yùn)用Venny 2.1.0軟件繪制大黃與炎癥的韋恩圖得到25個(gè)交集基因，見(jiàn)圖2。

圖2 大黃與炎癥的交集基因韋恩圖

Figure 2 The Venn Diagram of Intersection Gene Between Rhubarb and Inflammation

2.4 大黃PPI互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

為更進(jìn)一步分析大黃治療炎癥的作用機(jī)制，將25個(gè)交集基因上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)獲取TSV文本數(shù)據(jù)，利用Cytosccape 3.7.2軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。該網(wǎng)絡(luò)中25個(gè)靶點(diǎn)相互作用產(chǎn)生了85條蛋白互作的邊，平均度值為7.39，平均介數(shù)為0.039，根據(jù)節(jié)點(diǎn)的度值和介數(shù)中心性篩選出12個(gè)靶點(diǎn)，見(jiàn)表2。推測(cè)這些靶點(diǎn)可能是大黃抗炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中MYC與細(xì)胞周期、凋亡、生長(zhǎng)及血管生成有關(guān)，CASP3、JUN、CASP8、AR等與細(xì)胞凋亡有關(guān)，PTGS2、PGR與炎癥有關(guān)，IL1B與炎癥和細(xì)胞增殖、分化、凋亡相關(guān)，CDKN1A與細(xì)胞周期有關(guān)，PPARG跟血管調(diào)節(jié)有關(guān)，ESR1與細(xì)胞增殖相關(guān)，KDR與細(xì)胞增殖、存活、遷移有關(guān)，從以上靶點(diǎn)功能可預(yù)測(cè)，大黃可能都是通過(guò)細(xì)胞增殖、凋亡和血管調(diào)節(jié)發(fā)揮抗炎作用。

圖3 大黃PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

Figure 3 Network Diagram of the Rhubarb and PPI Protein Interaction

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

Table 2 The Topological Parameters of Key Target Spot

2.5 GO功能富集及KEGG通路富集分析

利用Metascape平臺(tái)對(duì)大黃的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，P設(shè)為0.01，獲取其參與生物過(guò)程的前20個(gè)基因功能富集，見(jiàn)圖4，主要涉及類(lèi)固醇激素反應(yīng)(11個(gè)靶點(diǎn))、凋亡信號(hào)通路(12個(gè)靶點(diǎn))、有毒物質(zhì)響應(yīng)(11)、細(xì)胞程序性死亡的正調(diào)控(11個(gè)靶點(diǎn))、營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)(10個(gè)靶點(diǎn))、脂多糖的反應(yīng)(8個(gè)靶點(diǎn))、MAPK級(jí)聯(lián)的調(diào)節(jié)(9個(gè)靶點(diǎn))、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控(8個(gè)靶點(diǎn))、氧含量的反應(yīng)(7個(gè)靶點(diǎn))、生長(zhǎng)增殖的負(fù)調(diào)控(6個(gè)靶點(diǎn))、損害的反應(yīng)(8個(gè)靶點(diǎn))、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的調(diào)節(jié)(5個(gè)靶點(diǎn))、活性氧代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)(5個(gè)靶點(diǎn))等，表明大黃參與多種生物過(guò)程調(diào)控抗炎的作用機(jī)制。

圖4 GO功能富集分析柱狀圖

Figure 4 The Histogram of Analyzing GO Functional Enrichment

通過(guò)KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，P小于0.01的信號(hào)通路有13條，分別涉及癌癥通路(13個(gè)靶點(diǎn))、核受體轉(zhuǎn)錄途徑(6個(gè)靶點(diǎn))、炎癥并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(6個(gè)靶點(diǎn))、PID ERA基因組途徑(5個(gè)靶點(diǎn))、IL-17信號(hào)通路(5個(gè)靶點(diǎn))、PID NFAT TF通路(4個(gè)靶點(diǎn))、PID RXR VDR通路(3個(gè)靶點(diǎn))、5-羥色胺能突觸信號(hào)通路(4個(gè)靶點(diǎn))、MAPK信號(hào)通路(5個(gè)靶點(diǎn))、PID P53下游通路(4個(gè)靶點(diǎn))、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路(4個(gè)靶點(diǎn))等，見(jiàn)圖5。并用KEGG mapper工具繪制癌癥通路的通路圖。上述結(jié)果提示大黃可能通過(guò)以上多條信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。

圖5 KEGG通路富集分析網(wǎng)絡(luò)圖

Figure 5 The Network Diagram of Pathways Enrichment of KEGG Analysis

圖6 癌癥信號(hào)通路圖

3 討論

已有研究報(bào)告顯示大黃具有抗炎的藥理作用，但是它們發(fā)揮作用的全面機(jī)制以及其他成分在抗炎中的作用機(jī)制還不完全清楚。大黃作為一種常見(jiàn)的中藏藥，其成分復(fù)雜，具有中藥典型的多成分、多靶點(diǎn)特點(diǎn)。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，并結(jié)合其他相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件對(duì)大黃治療炎癥的可能機(jī)制進(jìn)行了探討。研究發(fā)現(xiàn)大黃中發(fā)揮作用的主要有效成分有7個(gè)，其中蘆薈大黃素具有很高的口服利用度，而β-谷甾醇具有很高的類(lèi)藥性。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到大黃對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)74個(gè)，其中有效靶點(diǎn)25個(gè)，β-谷甾醇和蘆薈大黃素分別有26、19個(gè)靶點(diǎn)，β-谷甾醇是通過(guò)抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、MCP-1等和相關(guān)酶的過(guò)表達(dá)緩解急性結(jié)腸炎[3]。李曉紅等[4]和Hu等[5]考察蘆薈大黃素的抗炎作用及機(jī)制，結(jié)果顯示，蘆薈大黃素通過(guò)抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(i NOS)mRNA 表達(dá)，可明顯降低脂多糖刺激RAW264.7細(xì)胞的一氧化氮釋放，從而發(fā)揮抗炎作用。

根據(jù)PPI互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，MYC、Casp3、JUN、PTGS2、IL1β、ESR1等是大黃抗炎的主要靶點(diǎn)，如MYC是一個(gè)強(qiáng)大的原癌基因，有c-MYC、N-MYC、L-MYC三種[6]，c-MYC在細(xì)胞增殖和凋亡中具有雙重作用，與炎癥組織損傷和修復(fù)的多個(gè)方面有關(guān)[7]。Casp3調(diào)節(jié)不同的生物過(guò)程如凋亡、炎癥等[8]。JUN 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)AP-1亞單位之一，而 AP-1是位于JNK下游的關(guān)鍵信號(hào)蛋白分子，JNK受刺激后，可激活JUN，使其磷酸化，從而使炎癥轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)并增強(qiáng)，導(dǎo)致炎癥持續(xù)和發(fā)展[9]。PTGS2 是前列腺素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，而前列腺素是一種重要的炎癥介質(zhì)，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)[10]。白介素-1β介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，刺激單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，加重局部炎癥反應(yīng)[11]。ESR1可調(diào)節(jié)脂肪組織的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)，增強(qiáng)血管生成，減少炎癥和改善脂肪組織功能[12]。

GO功能富集分析結(jié)果顯示，GO功能富集主要涉及類(lèi)固醇激素反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、脂多糖的反應(yīng)、氧含量的反應(yīng)、損傷反應(yīng)、有毒物質(zhì)響應(yīng)、凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞程序性死亡的正調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控、MAPK級(jí)聯(lián)的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)增殖的負(fù)調(diào)控、活性氧代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)。KEGG通路分析結(jié)果顯示，KEGG通路分別涉及癌癥通路、炎癥并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、PID NFAT TF通路、PID RXR VDR通路、MAPK信號(hào)通路、PID P53下游通路、PID ERA基因組途徑和核受體轉(zhuǎn)錄途徑通路、5-羥色胺能突觸信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路等。

綜上，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從分子生物學(xué)層面分析了大黃的多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的抗炎機(jī)制。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究大黃抗炎機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。