趙長(zhǎng)江，張亞潔，龔教龍，于晶，趙志瑩，阮航，范博文，李佐同

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江省秸稈資源化利用工程技術(shù)研究中心；3.黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.黑龍江省普通高校寒地作物種質(zhì)改良與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

食用菌在整個(gè)生命過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種酶，有些在菌絲體內(nèi)起作用稱為胞內(nèi)酶，而有些酶被分泌到細(xì)胞外將有機(jī)物料分解為小分子物質(zhì)供菌絲生長(zhǎng)發(fā)育吸收利用，稱為胞外酶。食用菌胞外酶主要有纖維素酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶等多酶體系，其中纖維素酶主要包括有羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶和β-葡萄糖苷酶等，過(guò)氧化物酶和漆酶是木質(zhì)素酶的重要組成部分[1-4]。

食用菌胞外酶的種類、活性與培養(yǎng)基或培養(yǎng)料組成密切相關(guān)[5-6]，而且通過(guò)對(duì)蜜環(huán)菌、黃傘、元蘑、香菇等食用菌在不同培養(yǎng)料和不同生長(zhǎng)發(fā)育階段所分泌的胞外酶活性分析，指出胞外酶活性與生長(zhǎng)發(fā)育階段密切相關(guān)，并且呈現(xiàn)階段性變化，培養(yǎng)料的不同對(duì)胞外酶活性的變化趨勢(shì)影響小，但是對(duì)其活性影響較大[7-11]。其中，吳周斌等[3]研究指出不同培養(yǎng)料中真姬菇菌絲分泌的同種胞外酶，其活性在各生長(zhǎng)發(fā)育階段不同，真姬菇菌絲分泌的木質(zhì)素酶類（漆酶、錳過(guò)氧化物酶）活性最大值都在菌絲后熟階段，而非木質(zhì)素酶活性最大值則都在菌絲生殖階段。方宏陽(yáng)等[12]通過(guò)玉木耳及自交系菌株不同時(shí)期胞外酶活性與農(nóng)藝性狀關(guān)系的研究表明，出耳周期與菌絲生長(zhǎng)至培養(yǎng)料1/4 處到菌絲透壁前的羧甲基纖維素酶活呈正相關(guān)，產(chǎn)量與后熟期的漆酶活性呈負(fù)相關(guān)，與采收結(jié)束期的羧甲基纖維素酶活呈正相關(guān)，與菌絲透壁前的蛋白酶活性呈正相關(guān)。韓增華等[13]通過(guò)對(duì)黑木耳10 個(gè)菌株胞外酶活性及與栽培性狀和產(chǎn)量的關(guān)系研究指出，胞外漆酶、多酚氧化酶活性的變化趨勢(shì)大致相似，酶活性與栽培產(chǎn)量呈正相關(guān)。王宜磊[14]通過(guò)對(duì)彩絨革蓋菌木質(zhì)纖維素酶和木質(zhì)素酶活性分析，指出供試培養(yǎng)料中麩皮和酵母膏是該菌最適的碳、氮營(yíng)養(yǎng)。上述研究表明，食用菌胞外酶活性大小、動(dòng)態(tài)變化規(guī)律可以反映出食用菌微生物的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)以及培養(yǎng)料的配比等農(nóng)藝形狀和操作要求，從而為食用菌栽培料配方及栽培管理提供理論指導(dǎo)。

猴頭菌是我國(guó)珍貴的、食藥兼用的腐生真菌[15-18]。但是，關(guān)于該類食用菌對(duì)于不同碳氮營(yíng)養(yǎng)的響應(yīng)情況至今鮮有報(bào)道，研究通過(guò)對(duì)8 種碳源和8 種氮源營(yíng)養(yǎng)的液體培養(yǎng)猴頭菌的6 種胞外酶活性進(jìn)行解析，以期揭示猴頭菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的碳、氮利用規(guī)律，為猴頭菌生產(chǎn)栽培料的添加組配、栽培過(guò)程管理，以及食用菌產(chǎn)量品質(zhì)的調(diào)控提供理論指導(dǎo)和借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

猴頭菌（Hericium erinaceus）菌株RT22，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 培養(yǎng)試驗(yàn)

無(wú)菌條件下，將活化的菌種切割成0.5 cm2大小的菌絲塊，每瓶接3 塊菌絲塊，于180 rpm 搖床25 ℃培養(yǎng)8 d。每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.2.2 培養(yǎng)基配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖30.0 g，酵母膏10.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.6 g，定容至1 L。

不同碳源培養(yǎng)基：分別加入麥芽糖、乳糖、果糖、蔗糖、淀粉、纖維素和阿拉伯膠替代葡萄糖，濃度均為30 g·L-1。

不同氮源培養(yǎng)基：分別加入苯丙氨酸、谷氨酰胺、硝酸鉀、硝酸銨、尿素、硫酸銨和蛋白胨替代酵母膏，濃度均為10 g·L-1。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 羧甲基纖維素酶活性測(cè)定

取0.5 mL 培養(yǎng)液（酶液）和1.5 mL pH 4.6 的羧甲基纖維素鈉溶液混合，置40 ℃水浴鍋保溫30 min。沸水浴15 min 后，取0.5 mL 用DNS 法測(cè)還原糖生成量。用紫外分光光度計(jì)在540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值[19]。

1.3.2 半纖維素酶活性測(cè)定

將0.5 mL 酶液和1.0 mL 1%的木聚糖溶液混勻后，在50 ℃水浴鍋保溫1 h，取出加入2.0 mL DNS試劑，煮沸5 min，定容至20.0 mL。以煮沸滅活的酶液作對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值[19]。

1.3.3 淀粉酶活性測(cè)定

將0.5 mL pH 為5.6，0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液和0.5 mL 酶液混合勻后40 ℃水浴15 min，加入預(yù)熱的1%可溶性淀粉1.0 mL 混勻，40 ℃水浴5 min。加入2.0 mL 0.4 mol·L-1NaOH。取混合溶液2.0 mL 和2.0 mL DNS 試劑，煮沸5 min，冷卻后定容至25.0 mL，用紫外分光光度計(jì)在520 nm 波長(zhǎng)處測(cè)光密度值[19]。

1.3.4 濾紙纖維素酶活性測(cè)定

裁剪長(zhǎng)寬為1.0 cm × 6.0 cm 的新華定量濾紙條和0.5 mL 酶液（稀釋5 倍的粗酶液）放入刻度試管中混勻后在50 ℃水浴鍋保溫30 min，取出再加1.5 mL DNS 試劑，煮沸5 min，取出待冷卻后加入蒸餾水定容至20.0 mL，以煮沸滅活的酶液作對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值[19]。

1.3.5 漆酶活力測(cè)定

將0.5 mL，0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液（pH 5.6）和0.5 mL 酶液（稀釋5 倍的粗酶液）加入到刻度試管中，混勻后在40 ℃水浴鍋中保溫15 min，然后再加入預(yù)熱的1%可溶性淀粉1.0 mL，混勻，在40 ℃水浴鍋中保溫5 min，加入2.0 mL，0.4 mol·L-1NaOH 用來(lái)終止反應(yīng)。取混合溶液2.0 mL 和2.0 mL DNS 試劑加入到刻度試管中，煮沸5 min，取出冷卻，加入蒸餾水定容至25.0 mL，用紫外分光光度計(jì)在520 nm 波長(zhǎng)處測(cè)光密度值[19]。

1.3.6 過(guò)氧化物酶活性測(cè)定

在50.0 mL 0.1 M 的磷酸緩沖液（pH6.0）試管中，分別加入由過(guò)氧化氫28.0 μL 和愈創(chuàng)木酚19.0 μL，取混合物3.0 mL 和粗酶液1.0 mL 混合均勻，用紫外分光光度計(jì)在504 nm 波長(zhǎng)處測(cè)光密度值[19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及分析，利用SPSS Statistic 21.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)，差異顯著性及多重比較分析采用Duncan 檢驗(yàn)法處理，圖表數(shù)據(jù)均為3 次或3 次以上重復(fù)處理的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳氮對(duì)猴頭菌分泌羧甲基纖維素酶活性的影響

不同碳源和氮源處理的猴頭菌羧甲基纖維素酶活性變化如圖1 所示。在不同碳源處理下，葡萄糖碳源培養(yǎng)菌羧甲基纖維素酶活性最強(qiáng)（10.69 U），顯著高于麥芽糖處理（6.76 U），與其他處理差異不顯著，而且其余6 個(gè)供試碳源間該酶活性差異也不顯著；在不同氮源處理下，所有處理的猴頭菌羧甲基纖維素酶活性差異不顯著（8.01 U～11.48 U）。結(jié)果表明，碳源對(duì)猴頭菌羧甲基纖維素酶活性影響明顯，氮源對(duì)該酶活性影響不明顯。

圖1 不同碳氮培養(yǎng)基中猴頭菌羧甲基纖維素酶活性Fig.1 CMCase activity of H. erinaceus in different carbon and nitrogen cultures

2.2 不同碳氮對(duì)猴頭菌分泌濾紙纖維素酶活性的影響

不同碳源和氮源處理的猴頭菌濾紙纖維素酶活性變化如圖2 所示。在不同碳源處理下，葡萄糖（7.09 U）、果糖、麥芽糖、淀粉、纖維素和阿拉伯膠等6 個(gè)碳源對(duì)猴頭菌濾紙纖維素酶活性影響相近，處理間差異不顯著，其中葡萄糖和果糖培養(yǎng)酶活性顯著高于蔗糖和乳糖處理。在不同氮源處理下，苯丙氨酸與尿素氮源濾紙纖維素酶活性差異不顯著，其中苯丙氨酸處理酶活性最強(qiáng)（11.78 U），顯著高于其他處理；硝酸銨處理酶活性最弱（3.36 U），顯著低于供試的其他氮源。結(jié)果表明，碳源和氮源都可以引起猴頭菌濾紙纖維素酶活性顯著變化。

圖2 不同碳氮培養(yǎng)基中猴頭菌濾紙纖維素酶活性Fig.2 Filter paper cellulase activityof H. erinaceus in different carbon and nitrogen cultures

2.3 不同碳氮對(duì)猴頭菌分泌半纖維素酶活性的影響

不同碳源和氮源處理的猴頭菌半纖維素酶活性變化如圖3 所示。在不同碳源處理下，葡萄糖碳源培養(yǎng)該酶活性最高（1.19 U），顯著高于其余7 個(gè)碳源。在不同氮源處理下，尿素、苯丙氨酸、硝酸鉀、硝酸銨和硫酸銨等5 個(gè)供試氮源間猴頭菌半纖維素酶活性差異不顯著，但都顯著高于谷氨酰胺處理（0.84 U）。結(jié)果表明，碳源和氮源都可以引起猴頭菌半纖維素酶活性顯著變化，氮源對(duì)該酶影響更大。

圖3 不同碳氮培養(yǎng)基中猴頭菌半纖維素酶活性Fig.3 Hemicellulase activity of H. erinaceus in different carbon and nitrogen cultures

2.4 不同碳氮源對(duì)猴頭菌分泌淀粉酶活性的影響

不同碳源和氮源處理的猴頭菌淀粉酶活性變化如圖4 所示。在不同碳源處理下，葡萄糖（0.27 U）、果糖、麥芽糖、纖維素、阿拉伯膠等5 種碳源對(duì)猴頭菌淀粉酶活性影響相近，顯著高于蔗糖、乳糖和淀粉處理；其中阿拉伯膠處理該酶活性最強(qiáng)（0.29 U），淀粉處理酶活性最弱（0.14 U）。在不同氮源處理下，硝酸銨處理的猴頭菌淀粉酶活性最強(qiáng)（0.49 U），顯著高于蛋白胨、酵母膏、尿素、苯丙氨酸和谷氨酰胺等5 個(gè)氮源；硫酸銨與硝酸鉀和尿素處理的該酶活性間無(wú)顯著差異，其中蛋白胨處理的猴頭菌淀粉酶活性最弱（0.28 U）。結(jié)果表明，碳源和氮源都可以引起猴頭菌淀粉酶活性顯著變化，氮源對(duì)該酶影響更復(fù)雜。

圖4 不同碳氮培養(yǎng)基中猴頭菌淀粉酶活性Fig.4 Amylase activity of H. erinaceus in different carbon and nitrogen cultures

2.5 不同碳氮對(duì)猴頭菌分泌漆酶活力的影響

不同碳源和氮源處理的猴頭菌漆酶變化如圖5所示。在不同碳源處理下，阿拉伯膠與果糖處理的猴頭菌漆酶活性差異不顯著，二者顯著高于麥芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉和葡萄糖處理，其中阿拉伯膠處理酶活性最強(qiáng)（4.33 U），顯著高于其他所有處理；乳糖和淀粉處理猴頭菌漆酶活性無(wú)顯著差異，均顯著低于其他所有碳源處理，其中淀粉處理的猴頭菌漆酶活性最弱（0.25 U）。在不同氮源處理下，硝酸銨（4.75 U）、苯丙氨酸（4.58 U）、尿素（4.08 U）和硝酸鉀（3.71 U）處理無(wú)顯著差異，蛋白胨、酵母膏、谷氨酰胺和硫酸銨處理的猴頭菌漆酶活性間也無(wú)顯著差異，前4 個(gè)氮源處理猴頭菌漆酶活性顯著高于后4 個(gè)氮源處理。結(jié)果表明，碳源和氮源都可以引起猴頭菌濾紙纖維素酶活性顯著變化，碳源對(duì)該酶影響更復(fù)雜。

圖5 不同碳氮培養(yǎng)基中猴頭菌漆酶活性Fig.5 Laccase activity of H. erinaceus in different carbon and nitrogen cultures

2.6 不同碳氮對(duì)猴頭菌分泌過(guò)氧化物酶活性的影響

不同碳源和氮源處理的猴頭菌過(guò)氧化物酶活性變化如圖6 所示。在不同碳源處理下，麥芽糖、蔗糖、纖維素處理間無(wú)顯著差異，顯著高于其他5 個(gè)處理；而且5 個(gè)處理間該酶活性也無(wú)顯著差異；其中蔗糖處理酶活性最強(qiáng)（0.46 U），葡萄糖處理酶活性最弱（0.13 U）。在不同氮源處理下，谷氨酰胺與硫酸銨、硝酸銨處理的猴頭菌過(guò)氧化物酶活性差異不顯著，顯著高于其他處理；其中谷氨酰胺處理的猴頭菌過(guò)氧化物酶活性最強(qiáng)（0.30 U），硝酸鉀處理的猴頭菌過(guò)氧化物酶活性最弱（0.06 U）。

圖6 不同碳氮培養(yǎng)基中猴頭菌過(guò)氧化物酶活性Fig.6 Peroxidase activity of H. erinaceus in different carbon and nitrogen cultures

3 討論

大量研究表明，食用菌胞外酶的種類、活性不僅與食用菌的生長(zhǎng)發(fā)育階段密切相關(guān)，也與培養(yǎng)基或培養(yǎng)料配方組成密切相關(guān)，其中胞外酶的活性變化較為明顯[5-13]。研究中，除供試氮源對(duì)羧甲基纖維素酶活性影響不顯著外，供試的8 種碳源和8 種氮源對(duì)供試的6 種胞外酶活性均產(chǎn)生顯著影響。在不同碳源中，羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶和半纖維素酶活性在葡萄糖處理下最強(qiáng)，淀粉酶和漆酶活性在阿拉伯膠處理下最強(qiáng)，過(guò)氧化物酶活性在蔗糖處理下最強(qiáng)；在不同氮源中，羧甲基纖維素酶活性在蛋白胨處理下最強(qiáng)，濾紙纖維素酶活性在苯丙氨酸處理下最強(qiáng)，半纖維素酶活性在尿素處理下最強(qiáng)，淀粉酶和漆酶活性在硝酸銨處理下最強(qiáng)，過(guò)氧化物酶活性在谷氨酰胺處理下最強(qiáng)。其中，蛋白胨是猴頭菌羧甲基纖維素酶活性最適氮源的結(jié)果與賈素巧[19]的研究結(jié)論相佐證。

上述結(jié)果表明，供試16 種碳氮源的液體培養(yǎng)中，不同胞外酶最大活性的最適碳源和氮源不盡相同，而且，氮源對(duì)供試胞外酶活性影響要高于供試碳源?；诎饷父呋钚灾笜?biāo)的綜合考慮，猴頭菌液體培養(yǎng)最適培養(yǎng)基配方的碳源可優(yōu)先選擇葡萄糖，這與趙占國(guó)等[20]研究指出的猴頭菌栽培最適碳源為葡萄糖的結(jié)論一致；猴頭菌最適培養(yǎng)基配方中的營(yíng)養(yǎng)元素氮源可優(yōu)先選擇硝酸銨。荊瑞勇等[21]通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)金針菇胞外多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基碳源和氮源進(jìn)行優(yōu)化的研究中也指出硝酸銨0.5%是該菌最適的配方之一。此外，我們可以在食用菌栽培過(guò)程中添加不同碳源或氮源，來(lái)激發(fā)某些或某類胞外酶活性，從而提高其生物學(xué)效率，宋琪等[22]在金針菇的培養(yǎng)料中添加尿素能明顯提高金針菇的絕對(duì)生物學(xué)效率，我們推測(cè)可能與尿素有助于提高半纖維素酶活性有關(guān)。

4 結(jié)論

葡萄糖碳源培養(yǎng)基中猴頭菌羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶和半纖維素酶活性最高，上述纖維素酶類活性最適氮源分別為蛋白胨、苯丙氨酸、尿素；淀粉酶活性最高的碳源為阿拉伯膠，葡萄糖淀粉酶活性與阿拉伯膠相近，該酶的最適氮源為硝酸銨。猴頭菌漆酶和過(guò)氧化物酶的最適碳源分別為阿拉伯膠和蔗糖，最適氮源分別為硝酸銨和谷氨酰胺。上述結(jié)果表明，以結(jié)構(gòu)性或組成性物質(zhì)為底物的纖維素酶活性最適碳源相對(duì)穩(wěn)定，受氮源影響較大；猴頭菌氧化酶類活性受底物影響較大，可能與該類酶易受環(huán)境影響有關(guān)。研究在液體培養(yǎng)環(huán)境下揭示了猴頭菌對(duì)碳氮營(yíng)養(yǎng)的利用規(guī)律，可為該類食用菌生產(chǎn)栽培料的添加組配和栽培管理提供理論指導(dǎo)和借鑒。