農(nóng)達(dá)梅 左華江 吳春鳳

1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院，廣西 柳州 545006；2. 廣西科技大學(xué)，廣西 柳州 545006

咽炎在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)中作為一種常見的疾病。從相關(guān)病理和臨床癥狀上，可以將咽炎劃分為慢性類與急性類，其中慢性咽炎是咽黏膜和淋巴組織的慢性炎癥疾病[1]，經(jīng)常也屬于人體上呼吸道感染的慢性炎癥的一些表現(xiàn)。慢性咽炎一些主要癥狀表現(xiàn)為咽干、咽疼、咽癢、異物感、燒灼感、微痛、惡心、影響睡眠及影響日常生活等[2]。長期患咽炎的大眾，不加以治療，嚴(yán)重影響人的生活質(zhì)量。

金蕎麥(FagopyrumdibotrysHara)為蓼科蕎麥屬植物金蕎麥的根莖，其根莖為常用中藥材，是一種營養(yǎng)豐富并具有重要價(jià)值的藥資源植。金蕎麥別名野蕎麥、苦蕎頭、金鎖開銀等，在我國的四川、江西、江蘇等地都有分布。其性涼，味辛澀，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、排膿祛瘀功效，常用于咽喉腫痛、肺熱咳嗽、乳蛾腫痛、頭風(fēng)痛、消化不良、肝炎腹脹等病癥[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，金蕎麥有顯著的抗癌、抑制腫瘤細(xì)胞肺侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，此外還具有消炎抗菌、抗衰老、抗氧化酶活性解熱抗炎、祛痰鎮(zhèn)咳、抗血小板聚集、抗突變、以抵抗自由基的降血糖、血脂作用以及提高免疫力等藥理作用[4-6]。趙炎軍[7]在研究中認(rèn)為金蕎麥提取物具有一定的體外抗流感病毒作用。本研究利用網(wǎng)絡(luò)學(xué)藥理方法，從“藥物-化合物-作用靶點(diǎn)-疾病”復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)探究金蕎麥治療慢性咽炎的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)、分子生物學(xué)過程、信號(hào)通路等。以金蕎麥治療慢性咽炎的基礎(chǔ)研究提供參考思路。

1 方法

1.1 獲取金蕎麥主要化學(xué)成分及作用靶點(diǎn) 利用TCMSP(http://tcmspw.com/)數(shù)據(jù)庫找出金蕎麥所有的化學(xué)成分，以口服利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為條件篩選主要有效成分，根據(jù)DrugBank數(shù)據(jù)庫獲取主要化學(xué)成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，并將化合物靶標(biāo)蛋白逐一輸入String、UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)檢索以剔除重復(fù)、非人源的靶點(diǎn)，逐一轉(zhuǎn)化為主要活性化合物規(guī)范的靶點(diǎn)蛋白的基因標(biāo)識(shí)符(Gene Symbol)。

1.2 篩選慢性咽炎的相關(guān)靶點(diǎn)及潛在作用靶點(diǎn) Gene Cards數(shù)據(jù)庫克服了上百個(gè)數(shù)據(jù)庫自身格式的局限，整理歸納了基因表達(dá)、功能、位置、通路、變異、同源基因、疾病和相關(guān)參考文獻(xiàn)等各種信息，收集整理了上百個(gè)網(wǎng)站的內(nèi)容，并將它們合理地系統(tǒng)地整合到一起。OMIM數(shù)據(jù)庫涵概關(guān)于人類遺傳病和基因座位等相關(guān)信息、和文獻(xiàn)的中心級(jí)數(shù)據(jù)庫。通過以上兩個(gè)數(shù)據(jù)，篩選了有關(guān)慢性咽炎的靶點(diǎn)1272個(gè)。將上述1.1藥物主要化學(xué)成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venney2.1分析平臺(tái)，取交集靶點(diǎn)，獲得潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 金蕎麥化合物-疾病靶點(diǎn)及靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將篩選過后的主要化學(xué)成分與交集的潛在作用靶點(diǎn)輸入到Cytoscape3.7.0軟件，構(gòu)建“藥物-主要成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。同時(shí)將篩選得到的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String平臺(tái)(http://string-db.org)，將Organism設(shè)定為“Homo aspiens”，最小交互分?jǐn)?shù)取0.4，得到靶點(diǎn)互作的(PPI)網(wǎng)絡(luò)模型。由于STRING數(shù)據(jù)庫無法直觀的看出靶蛋白的Degree變化，故將STRING的蛋白互作信息保存為TSV格式并導(dǎo)入Cytoscape3.7.0軟件中采用Analyze network工具進(jìn)行可視化分析，篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)GO富集分析及相關(guān)信號(hào)通路注釋分析 為進(jìn)一步了解上述篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)的功能及相關(guān)信號(hào)通路的作用，將上述1.3的得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID6.8數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行GO(Gene Ontology)生物學(xué)過程富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes Genomes)信號(hào)通路富集分析，設(shè)置靶基因名稱為人類進(jìn)行篩選，將所有靶基因名稱校正為官方名稱(office gene symbol)，通過設(shè)定閾值P<0.01，得到生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)分和相關(guān)通路分析結(jié)果，并利用Origin7.5軟件將其結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 金蕎麥主要化學(xué)成分的篩選、收集 通過TCMSP平臺(tái)數(shù)據(jù)庫檢索“金蕎麥”，總化合物為45種，以O(shè)B ≥30%，DL≥0.18為篩選條件選出15個(gè)潛在治療作用的活性化學(xué)成分，見表1。15個(gè)活性化合物共有100個(gè)作用靶點(diǎn)。

表1 金蕎麥中主要化學(xué)物信息

2.2 共有靶點(diǎn)的收取 將金蕎麥潛在活性化合物的作用靶點(diǎn)與Gene Cards數(shù)據(jù)庫及OMIM數(shù)據(jù)庫檢索出的慢性咽炎疾病靶點(diǎn)在Venney2.1平臺(tái)做韋恩圖，交集靶點(diǎn)40個(gè)，可認(rèn)這40個(gè)靶點(diǎn)是金蕎麥治療慢性咽炎的主要靶點(diǎn)，如圖1。

圖1 金蕎麥活性成分靶點(diǎn)與慢性咽炎靶點(diǎn)Venny圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將金蕎麥治療慢性咽炎的40個(gè)主要靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，得到治療靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape進(jìn)行可視化。由圖2可知，線條表示靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)由260條邊組成一個(gè)完整的蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖。該圖中圓形的大小和顏色，從淺色圓形到深色橢圓形，形狀越來越大，顏色逐漸加深，表明Degree度值增大。PPI蛋白互作關(guān)系具體見表2(僅列出前20個(gè)靶點(diǎn))。由表2可知，靶點(diǎn)平均Degree為13，Average Shortest Path Length(平均最短路徑長度)在1.3到2.8之間，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的Closeness Centrality(連通度)、Betweenness Centrality(介數(shù)中心性)曲線接近于冪律分布，其中節(jié)點(diǎn)度值越大的節(jié)點(diǎn)，平均最短路徑長度越短的節(jié)點(diǎn)，表明該節(jié)點(diǎn)與慢性咽炎的相關(guān)性越大，治療慢性咽炎的可能性最大。超過靶點(diǎn)平均Degree的靶點(diǎn)有14個(gè)，可認(rèn)為這14個(gè)靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 潛在治療靶點(diǎn)蛋白互作圖

表2 交集靶點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)特征(表中僅列出前20個(gè))

2.4 金蕎麥化合物-疾病靶點(diǎn)構(gòu)建分析 從圖3可知，金蕎麥化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共有57個(gè)節(jié)點(diǎn)，127條邊，包含了1種藥物、1種疾病、15個(gè)化合物、40個(gè)靶點(diǎn)，其中藍(lán)色棱形為藥物，紅色橢圓形為疾病，黃色長方形為化合物，綠色三角形為靶點(diǎn)。從度值大小上來看，排名前4位為quercetin(槲皮素)、luteolin(木犀草素)、β-sitosterol (β-谷甾醇)、isorhamnetin(異鼠李素)，節(jié)點(diǎn)分別為34、17、8、5，這些化合物成分在治療慢性咽炎發(fā)揮著重要作用。

圖3 金蕎麥化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 相關(guān)通路信息和注釋分析 為了進(jìn)一步闡明金蕎麥活性成分的作用機(jī)制，將上述2.2預(yù)測(cè)得到的14關(guān)鍵靶蛋白導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)平臺(tái)(https://david.ncifcrf.gov)GO富集分析，得出148條目，其中包括生物學(xué)過程109條，分子功能30條，細(xì)胞組分9條，KEGG分析得到47條KEGG信號(hào)通路。經(jīng)Bonferroni校正P<0.01，符合條件的有生物學(xué)過程為46條，分別為凋亡過程的負(fù)調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、藥物反應(yīng)(response to drug)、上皮細(xì)胞增殖的陽性調(diào)節(jié)(positive regulation of epithelial cell proliferation)、細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素-1的反應(yīng)(cellular response to interleukin-1)、基因表達(dá)陽性調(diào)節(jié)(positive regulation of gene expression)等，見圖4。取P<0.01，符合條件的分子功能有15條，為酶綁定(enzyme binding)、蛋白質(zhì)異二聚化活動(dòng)(rotein heterodimerization activity)、轉(zhuǎn)錄激活子活性，RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端區(qū)序列特異性結(jié)合(transcriptional activator activity, RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific binding)、轉(zhuǎn)錄因子綁定(transcription factor binding)等，見圖5。取P<0.01，符合條件的細(xì)胞組分有核質(zhì)(nucleoplasm)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、核(nucleus)、膜(membrane)和膜筏(membrane raft)，見圖6。取P<0.01得到31條信號(hào)通路，包括蛋白聚糖在癌癥(Proteoglycans in cancer)、通路在癌癥(Pathways in cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、小分子核糖核酸在癌癥(MicroRNAs in cancer)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)等，見圖7。大量的靶蛋白富集在這些注釋和信號(hào)通路上，通過-log(p)值顯現(xiàn)富集相關(guān)性大小，p越小，-log(p)值越大，則與疾病相關(guān)可能性越大。通過生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分、相關(guān)信號(hào)通路來預(yù)測(cè)慢性咽炎，達(dá)到治療的目的。

注：圖中僅根據(jù)P值列出前20個(gè)生物學(xué)過程圖4 關(guān)鍵靶蛋白參與生物學(xué)過程

圖5 關(guān)鍵靶蛋白參與分子功能

圖6 關(guān)鍵靶蛋白參與細(xì)胞組分

注：圖中僅根據(jù)P值列出前20個(gè)KEGG圖7 信號(hào)通路柱狀圖

3 討論

慢性咽炎(Chronic Pharyngitis)是一種咽喉部黏膜、黏膜下組織及淋巴組織產(chǎn)生的慢性炎癥，主要患病人群為青壯年。慢性咽炎治療起來病程較長，且癥狀容易反復(fù)發(fā)作[8]。根據(jù)流行病學(xué)顯示，我國慢性咽炎一直存在著較高的發(fā)病率，特別是在空氣質(zhì)量較差的大城市，給眾多患者帶來煩惱和負(fù)擔(dān)，且較多的醫(yī)療資源用于治療咽炎。而引起咽炎的原因非常多，有慢性感染因素和非感染因素。前者為細(xì)菌類感染、菌群紊亂、鼻炎類；后者為職業(yè)性暴露、生活習(xí)慣及生活環(huán)境等[9]。慢性咽炎屬于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“喉痹”范疇，在《素問·陰陽別論》[10]中提出咽喉者為陰陽升降之路，喉痹之病機(jī)主要是人體出現(xiàn)陰陽失衡。而中藥金蕎麥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)，通過多途徑發(fā)揮直接或間接抗病菌、抗病毒治療慢性咽炎的作用?，F(xiàn)市場上金蕎麥片聯(lián)合蓮花清瘟膠囊可起到緩解甲型H1N1流感、咽喉腫痛作用。金蕎麥也可作單味藥單獨(dú)使用，具有抗炎、祛痰鎮(zhèn)咳的功效，是治療慢性咽炎的有效藥物，但相關(guān)報(bào)道較少。

本研究通過篩選得到的15種活性成分，主要是黃酮類、甾體、有機(jī)酸等化學(xué)成分，其中最有意義的是黃酮類，為主要的藥理活性成分[11]。具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫力等多種藥理學(xué)功效。從抗炎的角度探究，槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、異鼠李素對(duì)慢性咽炎的治療作用。劉濤等[12]在研究中表明了槲皮素、木犀草素對(duì)小鼠鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰的作用及對(duì)家兔的慢性咽炎治療作用。倪灣[13]闡述槲皮素的抗炎活性可通過NF-kB和Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥因子影響。研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素具有抗炎、抗病毒、抗氧化等作用，抗炎主要是通過抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的TNF-α，IL-1β和IL-6在體外和體內(nèi)的分泌[14]。β-谷甾醇大多數(shù)存在于植物細(xì)胞膜中，其抗炎主要機(jī)制是對(duì)脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，提高抗炎因子(IL-10)的活性[15]，β-谷甾醇臨床上常用于降低膽固醇。

金蕎麥治療慢性咽炎主要靶點(diǎn)為EGFR、CASP3、ESR1、MYC、IL6等14個(gè)。其中EGFR的變化代表慢性咽炎患者的病變水平，在孫恒[16]的研究中表明了血清EGFR的檢測(cè)在鼻咽癌患者臨床診治中的重要意義。CASP3作為半胱氨酸蛋白酶族的重要成員，可以通過細(xì)胞凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17]。MYC的過度表達(dá)是人類癌癥特征重要的一個(gè)特征，認(rèn)為MYC癌基因通過轉(zhuǎn)錄因子，解除大量特定靶蛋白表達(dá)的調(diào)控，可以通過預(yù)測(cè)咽炎轉(zhuǎn)化為咽炎癌類型癌癥。

經(jīng)過GO分析和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，可以發(fā)現(xiàn)金蕎麥的有效化合物能作用于多個(gè)位點(diǎn)。如EGFR、CASP3、IL6、MCL1、RELA、 VEGFA、MDM2、MYC參與凋亡過程的負(fù)調(diào)控的生物學(xué)過程；PGR、EGFR、 CCND1、 HIF1A、ESR1、MDM2參與分子功能中酶綁定；PGR、CASP3、CCND1、HIF1A、MCL1、RELA、ESR1、MDM2、MYC參與細(xì)胞組分中核質(zhì)的相關(guān)活動(dòng)；EGFR、CASP3、CCND1、HIF1A、ERBB2、VEGFA、ESR1、MDM2、MYC靶蛋白涉及在蛋白聚糖在癌癥通路上。

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種中藥研究的方法，研究了金蕎麥治療慢性咽炎的潛在作用機(jī)制，從而闡明了金蕎麥治療慢性咽炎有效成分與作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，并明確了金蕎麥通過多種活性成分、潛在作用靶點(diǎn)、各種生物學(xué)過程及信號(hào)通路發(fā)揮治療慢性咽炎的的作用機(jī)制，這為金蕎麥在慢性咽炎的治療中提供重要的參考價(jià)值。