超聲輔助植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁及草莓汁過程中菌體生長及酚類等物質(zhì)代謝

王紅梅,蔣思睿,陶 陽,韓永斌

(南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇 南京 210095)

近年來,隨著人們健康意識的增強,益生菌在飲食科學與商業(yè)領域引起廣泛關注。大多數(shù)乳酸菌都是益生菌,乳酸菌在腸道定植后,可以促使人體更好地吸收食物中的營養(yǎng)成分,緩解部分人群的乳糖不耐癥,控制由腸道感染引起的疾病以及抑制某些類型癌癥等[1]。目前人體攝入的益生菌主要來源于發(fā)酵乳制品,然而人們食用發(fā)酵乳制品仍然受到乳糖不耐受、膽固醇含量以及存在致敏原等因素限制[2]。隨著素食消費者增加,一些發(fā)達國家對于素食益生菌食品的需求也大大增加[3]。因此富含益生菌的非乳制品開發(fā)具有廣闊的前景。蘋果是世界上消費最多的水果之一,富含糖類、有機酸、多酚、維生素等營養(yǎng)成分。食用蘋果可以抑制心血管疾病、糖尿病等慢性疾病[4]。草莓漿果富含酚類物質(zhì),常溫下貯藏保鮮時間短,極易腐爛,浪費嚴重[5]。大多數(shù)的水果、蔬菜對人體的益處主要源于類黃酮、異黃酮和酚酸等酚類物質(zhì),而蘋果、草莓等常見水果及其加工產(chǎn)品是人類飲食中酚類物質(zhì)的主要來源之一[1]。利用乳酸菌發(fā)酵果汁既可以產(chǎn)生乳酸發(fā)酵的風味,又不失果蔬原料的自然風味,從而構成了發(fā)酵果汁的獨特風味。

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)在果蔬發(fā)酵領域應用廣泛,如果蔬汁的發(fā)酵和泡菜的制備[6]、葡萄酒的蘋果酸-乳酸發(fā)酵[7]等。植物乳桿菌能夠產(chǎn)生多種酶,一方面水解釋放酚類物質(zhì),另一方面轉(zhuǎn)化酚類物質(zhì)產(chǎn)生高附加值的生物活性物質(zhì)[8]。植物乳桿菌利用單寧酶水解單寧酸釋放沒食子酸[9];肉桂酸類物質(zhì)通常與植物細胞壁結(jié)合,需經(jīng)過酶解作用釋放,以供腸道細胞吸收[10];植物乳桿菌可產(chǎn)生阿魏酰酯酶,將阿魏酸和咖啡酸等從結(jié)合態(tài)釋放出來[11];沒食子酸、表兒茶酸以及黃酮醇、黃烷-3-醇的釋放也與酯酶活性有關[12-14]。此外,植物乳桿菌可產(chǎn)生酚酸脫羧酶、還原酶等酶,將p-香豆酸、阿魏酸、咖啡酸等酚酸轉(zhuǎn)化成重要的風味物質(zhì),如4-乙烯基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等,進而還原成相應的4-乙基衍生物,從而影響發(fā)酵果蔬的風味特征[15]。其次,沒食子酸、咖啡酸等酚酸經(jīng)植物乳桿菌代謝可轉(zhuǎn)化為具有強抗氧化活性的焦棓酸、二氫咖啡酸等,提高了果蔬制品的營養(yǎng)功能[8,16-17]。

近年來,許多研究表明低頻超聲波(20～50 kHz)可以促進發(fā)酵中細胞增長,縮短發(fā)酵時間;提高酶活性,促進微生物的代謝和相關生物轉(zhuǎn)化。羅娟[18]研究發(fā)現(xiàn),低場強功率超聲波促進了枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵豆粕,發(fā)酵后可溶性蛋白和多肽產(chǎn)量明顯提高,蛋白加工特性得到改善。低頻超聲波還可提高乳酸菌產(chǎn)乳酸的能力[19]。Huang Guoping等[20]研究發(fā)現(xiàn)低頻超聲波(28 kHz、100 W/L)可以提高L. paracasei發(fā)酵脫脂乳中多肽產(chǎn)量,增加活菌數(shù),推測多肽產(chǎn)量增加可能與超聲瞬間激活胞外酶有關。Yeo等[21]發(fā)現(xiàn)超聲在L. casei FTDC 2113發(fā)酵甘露醇-豆奶中增強了菌體細胞的增長,促進胞內(nèi)胞外β-葡萄糖苷酶的活性,異黃酮轉(zhuǎn)化增加。然而,目前關于超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵果蔬汁的研究鮮有報道。本研究選擇富含酚類物質(zhì)的蘋果汁和草莓汁作為發(fā)酵基質(zhì),選取不同強度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵,旨在探明超聲波對植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁和草莓汁過程中菌體生長、基本營養(yǎng)代謝以及酚類物質(zhì)變化的影響,以期為超聲輔助植物乳桿菌發(fā)酵果蔬汁的應用提供理論依據(jù),進而為超聲波對植物乳桿菌發(fā)酵果蔬過程中酚類物質(zhì)變化影響的機理研究提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘紅富士’蘋果 江蘇徐州大沙河果園;‘豐香’草莓鮮果 江蘇鎮(zhèn)江市句容市白兔鎮(zhèn)草莓園。植物乳桿菌BNCC337796凍干粉 北京北納生物保藏中心。

福林-酚、2,2’-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2’-amino-di (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) ammonium salt,ABTS)、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(2,4,6-tri(2-pyridyl)striazine,TPTZ)、酚類物質(zhì)、糖、有機酸等標準品 上海源葉生物科技有限公司;甲醇、乙腈、冰醋酸(均為色譜純) 國藥集團化學試劑有限公司;MRS瓊脂、MRS肉湯 上海博微生物科技有限公司;果膠酶(活力≥60 000 U/g) 浙江一諾生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

液相色譜儀 日本島津公司;1200系列液相色譜儀美國安捷倫公司;UV5100B紫外-可見光分光光度計上海元析儀器有限公司;GL-20G-II冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;JA2003型電子天平 上海精密科學儀器有限公司;WYT-J糖度計 成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司;VCX 130超聲細胞破碎儀 美國Sonics公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

植物乳桿菌BNCC337796凍干粉混勻在MRS肉湯中,37 ℃活化24 h后,與50%甘油溶液按照1∶1混合,于-20 ℃長期保存。另外取培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h后放置于4 ℃短期保存,作為整個研究中的種子液制備菌種。挑取斜面菌落接種于50 mL無菌MRS肉湯中,37 ℃培養(yǎng)24 h后作為活化的種子液使用。

1.3.2 蘋果汁和草莓汁制備

蘋果汁制備參照Liao Hongmei等[22]方法并修改。將蘋果去皮、去核,加入0.15% L-抗壞血酸鈉和10%的純凈水,打漿,4 層紗布過濾,4 000 r/min離心20 min,用葡萄糖調(diào)節(jié)可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)為13%,用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值至6.5(蘋果汁的自然pH值約為4.3),110 ℃滅菌10 min,滅菌后在無菌條件下進行分裝。

草莓汁制備參照陳瑋等[23]方法并修改。草莓經(jīng)清洗、去柄除萼后,破碎打漿,加入0.04%果膠酶,45 ℃水浴酶解90 min,4 層紗布過濾,4 000 r/min離心20 min,保留上清液,加葡萄糖調(diào)節(jié)至可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)為13%,用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值至4.0(基于前期實驗)。85 ℃水浴20 min滅菌,滅菌后在無菌條件下進行分裝。

1.3.3 發(fā)酵體系建立

將種子液以2%的接種量接種到蘋果汁和草莓汁中,初始菌數(shù)約為7.5(lg(CFU/mL)),37 ℃發(fā)酵。超聲頻率為20 kHz,超聲探頭位于液面以下約1 cm,設置58.3 W/L和93.6 W/L兩個超聲強度,每組在接種0、4、8、12、16、24、32 h后均超聲處理2 min,模式為5 s開、5 s關,整個發(fā)酵過程共計超聲7 次。每次超聲前,取發(fā)酵0、4、8、12、16、24、32、40 h后的發(fā)酵液,測定相應指標。以相同條件下發(fā)酵未超聲處理的蘋果汁和草莓汁作為對照。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 菌落數(shù)測定

采用平板菌落計數(shù)法測定發(fā)酵液中的植物乳桿菌數(shù)量,以lg(CFU/mL)表示。

1.3.4.2 糖含量測定

參照Vervoort等[24]方法,并稍作修改。采用安捷倫1200系列液相色譜儀,外部連接Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測器。色譜柱為Prevail carbohydrate ES column(250 mm×4.6 mm,5 μm)并連接一個Prevail C18柱(7.5 mm×4.6 mm,5 μm)作為保護柱。柱溫:30 ℃;流動相:乙腈-水(75∶25,V/V);流速:1 mL/min;運行時間:23 min;漂移管溫度:80 ℃;氮氣流速:1.5 L/min;進樣量:10 μL。采用標準品獲得保留時間和標準曲線對發(fā)酵液中游離糖進行定性和定量,結(jié)果表示為g/L。

1.3.4.3 有機酸含量測定

有機酸含量測定采用Lima等[25]的方法,并有所修改。采用液相色譜法,色譜柱為安捷倫TC-C18柱(4.6 mm×25 mm,5 μm);檢測波長:210 nm;流動相:0.08 mol/L KH2PO4溶液(用磷酸調(diào)pH 2.9)進行等梯度洗脫;柱溫:30 ℃;流速:0.7 mL/min;進樣量:20 μL。采用標準品獲得保留時間和標準曲線對發(fā)酵液中有機酸進行定性和定量,結(jié)果表示為mg/L。

1.3.4.4 總酚含量測定

采用福林-酚法[26],沒食子酸構建標準曲線,結(jié)果以沒食子酸當量(mg/L)表示。

1.3.4.5 單體酚含量測定[27]

酚酸和黃酮醇類的高效液相色譜分析采用Inertsil ODS-3柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫:25 ℃;流動相:A液為1%醋酸溶液,B液為1%醋酸-甲醇溶液;流速:0.6 mL/min;梯度按如下方式設定:0～10 min,90%～74% A,10%～26% B;10～25 min,74%～60%A,26%～40% B;25～45 min,60%～35% A,40%～65% B;45～55 min,35%～5% A,65%～95% B;55～58 min,5%～90% A,95%～10% B;58～65 min,90% A,10% B。酚酸類測定波長280 nm,黃酮醇類測定波長350 nm;進樣量20 μL。通過標準品建立標準曲線進行定量分析,結(jié)果表示為mg/L。

1.3.4.6 抗氧化活性測定

ABTS陽離子自由基清除能力測定參照Re等[28]的方法,以標準品Trolox制作標準曲線,結(jié)果以Trolox當量(mmol/L)表示。Fe3+還原力測定參照Benzie等[29]的方法,以FeSO4為標準物制作標準曲線,結(jié)果以Fe2+當量(mmol/L)表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復3 次,采用Excel 2007進行圖表制作,SPSS 20.0進行顯著性差異分析,Minitab 17進行主成分分析(principal component analysis,PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲對發(fā)酵過程中菌落生長的影響

植物乳桿菌在蘋果汁中發(fā)酵至24 h,基本進入穩(wěn)定期,菌落數(shù)達到8.59(lg(CFU/mL))(圖1A);在草莓汁中發(fā)酵至8 h即進入穩(wěn)定期,菌落數(shù)為8.21(lg(CFU/mL))(圖1B)。這可能是由于兩種果汁的初始pH值不同,滅菌后蘋果汁初始的pH值為5.52,而草莓汁的初始pH值為4.04。植物乳桿菌生長的最適pH值為6.5[30],較低的pH值環(huán)境限制了植物乳桿菌在草莓汁中的生長,因此草莓汁中植物乳桿菌較早進入穩(wěn)定期,且穩(wěn)定期菌落數(shù)低于蘋果汁中菌落數(shù)。由圖1A可知,58.3 W/L超聲處理提高了蘋果汁中乳桿菌的生長速率。從趨勢上看,在發(fā)酵過程中,58.3 W/L超聲處理的蘋果汁中乳桿菌數(shù)量一直高于未超聲組,特別是在32 h,58.3 W/L超聲處理的蘋果汁中植物乳桿菌數(shù)量為8.8 0(l g(C F U/m L)),比未超聲組高1.73%(P＜0.05),而93.6 W/L超聲處理對蘋果汁中乳桿菌的生長無明顯影響(P＞0.05),表明適當強度的超聲處理可以提高乳桿菌生長速率。在草莓汁發(fā)酵中,超聲處理延長了草莓汁中微生物生長的對數(shù)期。58.3 W/L和93.6 W/L超聲處理的菌落數(shù)在32 h后顯著高于未超聲組(P＜0.05),40 h后分別高于未超聲組4.73%和2.55%,這與Dahroud等[31]研究結(jié)果一致,其研究發(fā)現(xiàn)超聲處理(60%振幅,超聲15 s,10 g/L的蛋白胨)能夠延長對數(shù)期,提高菌體增長速率,對菌體細胞的生長繁殖有促進作用。這一方面可能是因為超聲有助于分散培養(yǎng)過程中形成的微生物細胞簇,促進菌體細胞與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸[32],另一方面較低強度超聲可改變菌體細胞的通透性和形態(tài)變化,加快細胞內(nèi)外物質(zhì)交換速率,從而加快微生物的生長速度[20]。此外超聲還可能會對細胞成分、功能或者遺傳方面產(chǎn)生影響,也可加快微生物的繁殖[32]。

圖1 超聲對蘋果汁（A）和草莓汁（B）發(fā)酵過程中的植物乳桿菌數(shù)量的影響Fig. 1 Effects of ultrasound on the quantity of L. plantarum during the fermentation of apple juice (A) and strawberry juice (B)

2.2 超聲對發(fā)酵過程中糖和有機酸類代謝的影響

表1 植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁過程中糖和有機酸含量變化Table 1 Changes in sugar and organic acid contents in apple juice during fermentation by L. plantarum

表1包含乳酸、蘋果酸、葡萄糖和果糖等8 個變量。PCA可將包含多個變量的數(shù)據(jù)進行降維處理,將主要信息保留在幾個不相關的主成分中,蘋果汁發(fā)酵樣本經(jīng)PCA后得到得分圖和載荷圖如圖2所示。由圖2A可見,發(fā)酵后蘋果汁樣本PC1值由正值變?yōu)樨撝?而在圖2B中,果糖、山梨醇、葡萄糖在PC1上的載荷值較高,且為正值,表明蘋果汁經(jīng)發(fā)酵后果糖、山梨醇和葡萄糖含量下降。以未超聲樣品為例,發(fā)酵前蘋果汁中果糖、山梨醇和葡萄糖質(zhì)量濃度分別為(32.76±0.03)、(3.85±0.01)g/L和(16.33±0.07)g/L,發(fā)酵至40 h,果糖、山梨醇和葡萄糖質(zhì)量濃度分別為(31.92±0.13)、(3.4 3±0.0 7)g/L和(1 4.1 0±0.3 9)g/L,葡萄糖下降最多,這可能與細菌細胞調(diào)控中的碳分解代謝物抑制現(xiàn)象有關,即當細菌暴露在兩種或兩種以上的碳源時,細菌會選擇性優(yōu)先利用能夠使自身快速生長的一種碳源,通常是葡萄糖[33]。由表1可知,發(fā)酵至24 h,93.6 W/L超聲組的葡萄糖含量顯著低于未超聲組,說明超聲可能促進了植物乳桿菌對葡萄糖的利用。

發(fā)酵前蘋果汁中最主要的有機酸是蘋果酸,質(zhì)量濃度為(1 659.71±82.67)mg/L,其次為檸檬酸,質(zhì)量濃度為(159.18±26.43)mg/L。結(jié)合圖2A、B可知,在發(fā)酵過程中,蘋果汁樣品的PC1值逐漸減小,而蘋果酸在PC1上載荷較大,且為正值,表明含量持續(xù)下降,反之,乳酸在載荷圖中PC1為負值,因此含量增加。另外,檸檬酸和丙酮酸在PC2上的載荷較大,且為正值,在發(fā)酵過程中,蘋果汁樣品的PC2值先增大后減小,表明檸檬酸和丙酮酸含量先增加后減小。至發(fā)酵結(jié)束時蘋果酸質(zhì)量濃度減少至(303.89±38.40)mg/L,這是因為植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁中存在蘋果酸-乳酸發(fā)酵,將蘋果酸轉(zhuǎn)化生成乳酸[34],因此發(fā)酵蘋果汁中的乳酸不僅來源于糖的代謝,也來源于蘋果酸代謝。發(fā)酵早期丙酮酸含量上升可能是作為糖酵解產(chǎn)物積累,而后期下降可能是因為丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸或者其他代謝產(chǎn)物[33];由表1可知,發(fā)酵24 h后,兩個不同強度超聲處理下,丙酮酸含量均顯著高于未超聲組,結(jié)合前述超聲可能促進了葡萄糖的利用,因此進一步推測超聲可能促進了糖酵解。檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物,其含量處于動態(tài)變化中。早期由于發(fā)酵體系中殘留部分氧,乳酸菌進行有氧呼吸,使得丙酮酸代謝產(chǎn)生檸檬酸[35],因此含量增加,后期檸檬酸含量降低可能是由于乳酸菌降解生成乳酸、乙酸和雙乙酰等產(chǎn)物[36];乳酸含量上升,成為發(fā)酵蘋果汁中的主要有機酸。發(fā)酵8 h,檸檬酸含量在整個發(fā)酵過程中最高,58.3 W/L和93.6 W/L超聲組的檸檬酸質(zhì)量濃度分別為(1 438.76±28.57)mg/L和(2 020.84±147.52)mg/L,比未超聲組高155.87%和259.39%(P＜0.05),這可能是因為超聲過程中導致果汁中溶氧增多,從而促進了植物乳桿菌的有氧呼吸[37]。

圖2 植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁和草莓汁過程中糖和有機酸PCAFig. 2 Principal component analysis of sugars and organic acids in apple juice and strawberry juice during fermentation by L. plantarum

表2 植物乳桿菌發(fā)酵草莓汁過程中糖和有機酸含量變化Table 2 Changes in sugar and organic acid contents in strawberry juice during fermentation by L. plantarum

表2為草莓汁發(fā)酵過程中糖和有機酸組分變化,PCA見圖2C、D。發(fā)酵24 h與發(fā)酵40 h的樣品在圖2C中很靠近,說明兩個時間樣品糖和有機酸組分接近,因此,植物乳桿菌發(fā)酵對草莓汁中糖和有機酸含量的影響主要是在前24 h。這可能也是由于草莓汁初始較低的pH值環(huán)境限制了植物乳桿菌的生長。草莓汁發(fā)酵結(jié)束時,與未發(fā)酵草莓汁相比,主要表現(xiàn)在PC1值增大,而在載荷圖2D中顯示檸檬酸、蘋果酸、蔗糖PC1值為負值,表明這3 種成分含量下降,而乳酸、丙酮酸、葡萄糖、果糖PC1值為正值,其對應含量增加。蔗糖含量下降說明植物乳桿菌能夠產(chǎn)生蔗糖水解酶等分解利用蔗糖,一部分為微生物生長代謝提供能量,另一部分積累使得葡萄糖、果糖含量增加[33]。另外植物乳桿菌在pH值較低的草莓汁中發(fā)酵時,可能優(yōu)先利用檸檬酸和蘋果酸作為碳源[38]。發(fā)酵至40 h,93.6 W/L超聲處理的蔗糖質(zhì)量濃度(9.15±0.06)g/L顯著低于未超聲處理(9.28±0.07)g/L,而且9 3.6 W/L超聲處理草莓汁的果糖質(zhì)量濃度(12.76±0.04)g/L也顯著高于未超聲組(12.25±0.27)g/L,說明超聲促進了蔗糖的分解。

2.3 超聲對發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)代謝的影響

2.3.1 對總酚含量的影響

由圖3A可知,蘋果汁發(fā)酵前的總酚質(zhì)量濃度為(1 531.33±2.36)mg/L,未超聲處理組發(fā)酵8 h后,總酚含量增加了0.87%,發(fā)酵8～40 h期間,總酚含量下降,發(fā)酵結(jié)束后,總酚質(zhì)量濃度為(1 519.67±2.36)mg/L。由圖3B可知,草莓汁的總酚含量持續(xù)升高。在0～8 h,未超聲處理組總酚質(zhì)量濃度由(1 314.67±2.36)mg/L增加至(1 374.67±21.21)mg/L,在8～40 h,總酚含量仍有小幅增加,但是增速大大減緩,這可能是因為一些不溶性的酚類物質(zhì)經(jīng)乳酸菌的水解作用在前8 h大量釋放出來,所以總酚含量大幅提升,而在8 h后植物乳桿菌生長減緩,代謝也減弱,所以總酚含量變化較小[39]。蘋果汁與草莓汁中總酚含量的變化趨勢不同,說明發(fā)酵對酚類化合物的影響與發(fā)酵原料有關,這可能是不同果汁體系中酚類物質(zhì)存在形式不同所致。在現(xiàn)有乳酸發(fā)酵果蔬研究中,總酚含量的變化趨勢也不盡相同,Ricci[40]、Kwaw等[41]分別發(fā)酵接骨木汁和桑葚汁,發(fā)現(xiàn)總酚含量上升。而Hashemi[42]、Ankolekar[43]等分別發(fā)酵青檸和蘋果后發(fā)現(xiàn)總酚含量下降。總酚含量增加可能是發(fā)酵前的一些可溶性結(jié)合酚的羥基部分與長鏈醇等物質(zhì)結(jié)合,不能被測定,而植物乳桿菌能夠產(chǎn)生某些水解酶,將一些結(jié)構復雜的植物化學成分水解為小分子,比如將糖基化酚類物質(zhì)脫糖,從植物細胞壁中釋放出可溶性或不可溶性的結(jié)合性酚類化合物[41]。總酚含量下降則可能是因為乳酸菌可產(chǎn)生酚酸脫羧酶等將一些酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成乙烯基兒茶酚、乙烯基苯酚和乙烯基愈創(chuàng)木酚,進一步還原得到對應的乙基衍生物等揮發(fā)性酚[44]。在蘋果汁發(fā)酵至24 h和40 h時,58.3 W/L超聲處理組總酚含量顯著低于未超聲組。在草莓汁發(fā)酵過程中,兩個不同強度的超聲處理下總酚含量的變化與未超聲組無明顯差異,這說明在不同發(fā)酵體系中超聲對酚類物質(zhì)代謝的影響也是不同的。

圖3 超聲對植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁（A）和草莓汁（B）過程中總酚含量的影響Fig. 3 Effect of ultrasound on total phenol content in apple juice (A)and strawberry juice (B) during fermentation by L. plantarum

2.3.2 對單體酚代謝的影響

表3 植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁過程中酚類物質(zhì)含量變化Table 3 Changes in phenolic contents in apple juice during fermentation by L. plantarum

圖4 植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁和草莓汁過程中酚類物質(zhì)PCAFig. 4 Principal component analysis of phenolic substances in apple and strawberry juices fermented by L. plantarum

蘋果汁發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)含量變化如表3所示,經(jīng)過PCA得到圖4A、B。圖4A中,蘋果汁發(fā)酵樣本的PC1值隨發(fā)酵時間延長而逐漸減小,其中,未發(fā)酵的樣品和發(fā)酵8 h后的樣品分布于PC1的正區(qū)間,發(fā)酵24 h和40 h的樣品分布于PC1的負區(qū)間。而在載荷圖(圖4B)中對香豆酸、綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸和阿魏酸對應的PC1值為正值,說明這幾種酚類物質(zhì)含量在發(fā)酵后均降低。以未超聲樣品為例,發(fā)酵前對香豆酸、綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸和阿魏酸質(zhì)量濃度分別為(1.73±0.02)、(80.27±0.45)、(1.25±0.04)、(43.08±0.05)mg/L和(3.56±0.02)mg/L,發(fā)酵結(jié)束后分別降低了6.94%、7.69%、48%、4.25%和5.62%。與之相反,沒食子酸、根皮酸在載荷圖中對應的PC1值為負值,經(jīng)發(fā)酵后含量增加。以未超聲樣品為例,發(fā)酵前沒食子酸和根皮酸質(zhì)量濃度分別為(18.38±0.12)mg/L和(0.59±0.00)mg/L,發(fā)酵結(jié)束后分別增加了5.33%和33.90%。咖啡酸含量在發(fā)酵過程中先增加后減小,在8 h含量最高,為(2.13±0.00)mg/L。己有文獻報道[45-46],一些乳酸菌能將綠原酸分解代謝生成咖啡酸,因此發(fā)酵前期咖啡酸含量的增加與綠原酸在植物乳桿菌產(chǎn)生的酯酶作用下降解為咖啡酸和奎尼酸有關,其后的下降可能是因為咖啡酸又在酚酸脫羧酶和還原酶等作用下轉(zhuǎn)化生成乙烯基兒茶酚、乙基兒茶酚和二氫咖啡酸等衍生物,這與Markkinen等[38]研究結(jié)果相似。與咖啡酸類似,對香豆酸和阿魏酸也可作為乳酸菌的一種外部電子受體在酚酸脫羧酶和還原酶的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化從而產(chǎn)生系列衍生物,如對香豆酸被還原轉(zhuǎn)化為根皮酸[44],本研究中根皮酸含量的增加進一步佐證了植物乳桿菌具有將對香豆酸還原生成根皮酸的能力。沒食子酸含量上升可能與一些酯型的沒食子酸衍生物的水解釋放有關,己有研究報道乳酸菌在發(fā)酵過程中具有移除糖基、水解沒食子酸?；茸饔肹14]。這些乳酸菌對酚類物質(zhì)的分解代謝產(chǎn)物,相較于其母體酚類物質(zhì)而言,能夠發(fā)揮出與人類健康更加相關的生物活性,Silva等[47]報道二氫咖啡酸是一種比咖啡酸更有效的抗氧化劑。

由圖4A也可以看出,在不同的時間段,未超聲組與超聲組在酚類組分方面存在一定差異。在發(fā)酵8 h,58.3 W/L超聲組和93.6 W/L超聲組在PC2的分值均高于未超聲樣品,而在圖4B中對香豆酸和沒食子酸在PC2上的載荷較大,且為正值,其酚類差異主要存在于對香豆酸和沒食子酸,結(jié)合表3可知,超聲組對香豆酸顯著高于未超聲處理,沒食子酸含量也高于未超聲處理,但差異不顯著。另外,由表3可知,58.3 W/L和93.6 W/L的咖啡酸質(zhì)量濃度分別為(3.42±0.15)、(4.25±0.18)mg/L,分別比未超聲組高60.56%和99.53%。之后,超聲組與未超聲組的差異主要表現(xiàn)在PC1,發(fā)酵至24 h,93.6 W/L超聲組咖啡酸和對香豆酸仍然顯著高于未超聲處理組,而阿魏酸與之相反,93.6 W/L超聲組根皮酸質(zhì)量濃度為(0.76±0.02)mg/L,比未超聲組高13.43%(P＜0.05)。在發(fā)酵40 h內(nèi),超聲處理的綠原酸和原兒茶酸含量始終顯著低于未超聲組。而且在40 h,93.6 W/L超聲處理的綠原酸含量比未超聲組低10.44%(P＜0.05)。由圖4C可以看出,發(fā)酵過程中的草莓汁樣本主要分布在3 個不同的區(qū)域。發(fā)酵8 h后的草莓汁樣本與未發(fā)酵樣品比較,PC1值減小,而在圖4D中綠原酸、咖啡酸和對香豆酸在PC1上的載荷較大,且為正值,所以綠原酸、咖啡酸和對香豆酸含量減少,相反對羥基苯甲酸和沒食子酸含量增加。發(fā)酵24 h樣品和發(fā)酵8 h樣品相比,樣品PC2值增大,而綠原酸、對香豆酸、對羥基苯甲酸和沒食子酸的PC2在圖4D中為負值,說明含量降低,而咖啡酸PC2為正值,含量升高。發(fā)酵40 h與發(fā)酵24 h樣品在得分圖中很靠近,說明2 個時間樣品酚類組分相似。兒茶素在圖4D中靠近原點,說明此變量對PC1和PC2影響較小,由表4可知,兒茶素含量在發(fā)酵過程中先增加后減小。草莓汁發(fā)酵至8 h和24 h,93.6 W/L超聲處理組的對香豆酸含量均顯著低于未超聲組。結(jié)合蘋果汁和草莓汁中酚類物質(zhì)的變化看,超聲在發(fā)酵前期可提高分解咖啡酰酚類物質(zhì)的水解酶活性,從而使綠原酸含量更低,而咖啡酸含量更高;而在發(fā)酵后期超聲可提高酚酸還原酶的活性,從而促進對香豆酸、阿魏酸的轉(zhuǎn)化,這一現(xiàn)象可在后續(xù)研究中通過測定轉(zhuǎn)化途徑中關鍵酶,以及利用轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學手段進一步研究驗證。

表4 植物乳桿菌發(fā)酵草莓汁過程中酚類物質(zhì)含量變化Table 4 Changes in phenolic contents in strawberry juice during fermentation by L. plantarum

2.4 超聲對果汁發(fā)酵液抗氧化活性的影響

圖5 超聲輔助發(fā)酵過程中抗氧化活性變化Fig. 5 Changes in antioxidant activity of apple and strawberry juices during ultrasound-assisted fermentation

由圖5A可知,93.6 W/L超聲組植物乳桿菌發(fā)酵的蘋果汁在發(fā)酵24 h后ABTS陽離子自由基清除能力顯著提高。直至40 h,其抗氧化活性達到最高,為(52.17±1.59)mmol/L,分別比58.3 W/L超聲組和未超聲組高13.14%和36.21%(P＜0.05)。58.3 W/L超聲組蘋果汁在發(fā)酵過程中其清除ABTS陽離子自由基能力先增加后下降,在24 h抗氧化活性最高,為(51.76±2.18)mmol/L,與93.6 W/L超聲處理組((51.31±0.28)mmol/L)無顯著差異,但是顯著高于未超聲組((43.92±3.46)mmol/L)。未超聲組的ABTS陽離子自由基清除能力在發(fā)酵過程中無明顯變化。如圖5B所示,植物乳桿菌發(fā)酵草莓汁過程中,ABTS陽離子自由基清除能力在發(fā)酵過程中均為先增大后減小。58.3 W/L超聲組經(jīng)發(fā)酵8 h后,對ABTS陽離子自由基的清除能力顯著提高,達到(73.55±1.69)mmol/L,顯著高于未超聲組((58.31±5.40)mmol/L),但與93.6 W/L超聲組((69.45±2.47)mmol/L)無顯著差異。93.6 W/L超聲組和未超聲組草莓汁清除ABTS陽離子自由基能力均在發(fā)酵24 h達到最大值,分別為(73.59±0.99)、(74.01±3.67)mmol/L。以上結(jié)果表明,超聲輔助發(fā)酵的蘋果汁和草莓汁的抗氧化活性均有一定的提升。與Kwaw等[41]采用L. plantarum、L. paracasei和L. acidophilus三種乳酸菌發(fā)酵桑葚汁后,抗氧化活性提高的研究結(jié)果類似。Hur等[48]認為利用發(fā)酵提高植物性食品的抗氧化活性可能受到微生物種類、pH值、溫度、溶劑、含水量、發(fā)酵時間、食品種類和有氧條件等多種因素的影響。本研究中蘋果汁和草莓汁對ABTS陽離子自由基的清除能力與總酚含量變化不相關,這可能是因為抗氧化活性還受到酚類物質(zhì)的組分以及其他抗氧化物質(zhì)的影響。此外蘋果汁中綠原酸含量和原兒茶酸含量與ABTS陽離子自由基清除能力呈顯著負相關,這說明綠原酸和原兒茶酸分解轉(zhuǎn)化后可生成一些對ABTS陽離子自由基清除能力更強的物質(zhì),其具體機制有待進一步研究。此外很多乳酸菌具有酶促和非酶氧化機制,本身也具有一定的抗氧化活性。超聲處理促進了發(fā)酵蘋果汁和草莓汁ABTS陽離子自由基清除能力的提高,一方面可能是因為超聲過程中產(chǎn)生自由基[49],誘導乳酸菌產(chǎn)生一些保護自己免受氧化損傷的酶促抗氧化劑和非酶抗氧化劑;另一方面超聲可能促進了酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關酶的活性,產(chǎn)生更多強抗氧化活性衍生物,從而提高整個發(fā)酵體系的抗氧化活性。由圖5C、D可知,蘋果汁和草莓汁經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后,其Fe3+還原力無明顯變化(P＞0.05)。測定ABTS陽離子自由基清除能力是通過在特定條件下,樣品對檢測體系中自由基的清除能力以反映被測物的抗氧化活性;Fe3+還原力測定法是在特定條件下,測定樣品的還原能力以反映被測物的抗氧化活性。兩種方法基于不同的機制,可能會得到不同的結(jié)果[50]。

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)在不同的水果汁基質(zhì)中,植物乳桿菌的生長代謝有所不同。相比于草莓汁,植物乳桿菌更適宜于在經(jīng)過調(diào)整的蘋果汁中生長。超聲處理在蘋果汁和草莓汁的發(fā)酵過程中對植物乳桿菌的生長有一定的促進作用。發(fā)酵至32 h,58.3 W/L超聲處理的蘋果汁中植物乳桿菌數(shù)量比未超聲組高0.15(lg(CFU/mL))(P＜0.05)。在草莓汁發(fā)酵過程中,58.3 W/L和93.6 W/L超聲處理延長了植物乳桿菌的對數(shù)期,且40 h后菌落數(shù)分別比未超聲組高0.39、0.21(lg(CFU/mL))(P＜0.05)。超聲促進了植物乳桿菌對葡萄糖的利用,蘋果汁發(fā)酵24 h,93.6 W/L超聲組葡萄糖含量顯著低于未超聲組,因此作為糖酵解的產(chǎn)物,超聲組丙酮酸含量也顯著高于未超聲組。超聲促進蔗糖的分解,草莓汁發(fā)酵24 h后,93.6 W/L超聲組蔗糖含量顯著低于未超聲組,發(fā)酵40 h后,超聲組果糖含量更高。此外,蘋果汁中檸檬酸含量先增加后減小,58.3 W/L和93.6 W/L超聲處理的檸檬酸含量在發(fā)酵8 h分別比未超聲組高155.87%和259.39%(P＜0.05),超聲對檸檬酸代謝的影響機制有待進一步研究。在蘋果汁發(fā)酵中,超聲影響了多種酚類物質(zhì)的變化,主要促進了蘋果汁中綠原酸水解轉(zhuǎn)化為咖啡酸。超聲組的綠原酸含量一直低于未超聲組(P＜0.05),40 h后58.3 W/L和93.6 W/L超聲處理組分別比未超聲組低5.82%和10.44%,而且發(fā)酵后8～24 h超聲組咖啡酸含量高于未超聲組(P＜0.05),發(fā)酵8 h后,58.3 W/L和93.6 W/L超聲處理分別比未超聲組高60.56%和99.53%。與未超聲相比,超聲處理在蘋果汁發(fā)酵后期和草莓汁發(fā)酵前期提高了ABTS陽離子自由基清除能力。

綜上所述,超聲波可促進植物乳桿菌的增長、蘋果汁中綠原酸的水解、糖的分解利用以及蘋果汁發(fā)酵前期檸檬酸的合成,而且提高了兩種發(fā)酵果汁的ABTS陽離子自由基清除能力。該結(jié)果可為超聲輔助植物乳桿菌發(fā)酵果蔬汁的應用提供理論依據(jù)。除超聲強度外,其他超聲條件對乳酸發(fā)酵中菌體生長、基本代謝、酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響需要進一步研究,以便更好地將超聲應用到發(fā)酵果蔬汁的生產(chǎn)中。