黎佩怡 陳志云

廣東省惠州市中心人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東惠州 516000

在體外受精-胚胎移植技術(shù)中，囊胚培養(yǎng)是世界公認(rèn)篩選最具有活力胚胎的方法，對(duì)第三天胚胎行囊胚培養(yǎng)后移植可提高種植率和妊娠率[1]。此外，囊胚移植被認(rèn)為可以更好地協(xié)調(diào)胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)環(huán)境的同步[2-3]?；谶@些研究，選擇性單囊胚移植逐漸成為一種保證高臨床妊娠率并且降低多胎妊娠率的方法。自囊胚培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展至今，由Gardner 和 Schoolscraft 建立的囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)被胚胎學(xué)家應(yīng)用于挑選最有種植潛力的囊胚[4]。根據(jù)該評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，每一個(gè)囊胚的擴(kuò)張程度分為1 ～6期，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞則根據(jù)細(xì)胞的大小和緊密程度分為A、B、C 三級(jí)。但在囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分類(lèi)似的情況下，如4AB 和4BA，臨床醫(yī)生和胚胎學(xué)家面對(duì)的問(wèn)題是：哪個(gè)才是最佳囊胚？然而，對(duì)于優(yōu)先考慮內(nèi)細(xì)胞團(tuán)還是滋養(yǎng)細(xì)胞層的評(píng)分，目前國(guó)內(nèi)外研究尚無(wú)定論[5-6]。本研究探討在復(fù)蘇周期中如何選擇形態(tài)學(xué)評(píng)分相近的單囊胚，為未來(lái)選擇性單囊胚移植策略提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從本院生殖醫(yī)學(xué)中心的輔助生殖管理系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出2014 年1 月～2020 年1 月進(jìn)行的單個(gè)四期囊胚移植復(fù)蘇周期共810 個(gè)，回顧性分析患者臨床資料。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜40 周歲；（2）復(fù)蘇后完全存活并在移植前擴(kuò)張為四期的單個(gè)囊胚；（3）子宮內(nèi)膜厚度為7 ～14mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）雙囊胚移植；（2）新鮮囊胚移植周期；（3）囊胚復(fù)蘇后有細(xì)胞裂解并導(dǎo)致評(píng)分降低的周期；（4）失訪的移植周期。

1.2 囊胚培養(yǎng)

所有研究對(duì)象的超促排卵方案按本中心常規(guī)方法進(jìn)行。在B 超引導(dǎo)下進(jìn)行取卵手術(shù)，獲卵后通過(guò)常規(guī)體外受精或單精子卵胞漿內(nèi)注射進(jìn)行授精。授精后第三天根據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分進(jìn)行新鮮胚胎移植或冷凍，患者簽署知情同意書(shū)后剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)。

1.3 囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分

本中心使用的囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分方法同Gardner 和Schoolscraft 的評(píng)分方法[4]。根據(jù)囊胚的擴(kuò)張程度分為1 ～6 期，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞層的數(shù)量和形態(tài)分級(jí)為：A.細(xì)胞數(shù)目多且排列緊密；B.細(xì)胞數(shù)目較少且排列松散；C.細(xì)胞數(shù)目很少。

1.4 囊胚玻璃化冷凍與復(fù)蘇

研究期間囊胚冷凍與復(fù)蘇所使用的冷凍液、復(fù)蘇液和載桿購(gòu)買(mǎi)自瑞典Vitrolife 公司產(chǎn)品。囊胚冷凍之前通過(guò)激光進(jìn)行人工皺縮，移入Vitri 1TM Blast 溶液中停留10min，再移入Vitri 2TM Blast 溶液中2min，在還有30s 結(jié)束時(shí)，將20μL Vitri 3TM Blast 溶液滴于無(wú)毒培養(yǎng)皿表面，當(dāng)還有10s 結(jié)束時(shí)，收集囊胚并將其移至Vitri 3TM Blast 溶液液滴中，再將囊胚注入Rapid-iTM 載桿孔中，封口后移到液氮里保存。囊胚復(fù)蘇時(shí)將Rapid-iTM 載桿取出并將其空洞置于Warm 1TM Blast 溶液中2min，將囊胚移至Warm 2TM Blast 溶液中3min，將囊胚移至Warm 3TM Blast 溶液中10min，將囊胚轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的移植皿中等待移植。

1.5 復(fù)蘇周期內(nèi)膜準(zhǔn)備與囊胚移植

患者提前進(jìn)行自然周期或人工周期準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜。囊胚復(fù)蘇后2h 觀察形態(tài)，囊胚腔重新擴(kuò)張且評(píng)分不變的情況下，在B 超引導(dǎo)下行囊胚移植。

1.6 妊娠結(jié)局的判斷

囊胚移植術(shù)后14 ～16d，電話隨訪其血清β-HCG 試驗(yàn)結(jié)果，若β-HCG 隔天快速下降且B超未見(jiàn)胎囊，可判斷為生化妊娠；術(shù)后30 ～35d 行B 超檢查，可見(jiàn)胎囊，判斷為臨床妊娠；若在妊娠12周內(nèi)自然流產(chǎn)，判斷為早期自然流產(chǎn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

根據(jù)不同的統(tǒng)計(jì)類(lèi)型，應(yīng)用SPSS20.0 軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單個(gè)四期囊胚移植的妊娠結(jié)局

共復(fù)蘇810 個(gè)周期，復(fù)蘇率和存活率均為100%，移植前觀察所有囊胚的囊胚腔均擴(kuò)張為四期。其中435 例獲得臨床妊娠，臨床妊娠率為53.7%，生化妊娠率為9.4%，早期流產(chǎn)率為14.9%。

2.2 形態(tài)學(xué)評(píng)分相近的囊胚對(duì)妊娠結(jié)局的影響

形態(tài)學(xué)評(píng)分相近的囊胚（4AB 組與4BA 組、4BC 組與4CB 組）患者的基本情況分析顯示，年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH 水平、獲卵數(shù)、授精方式、內(nèi)膜厚度、復(fù)蘇周期的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和D5/D6 囊胚比例的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表1 ～2。4AB 組與4BA 組的妊娠結(jié)局分析顯示，臨床妊娠率（66.7% vs 66.1%）、生化妊娠率（4.2% vs 5.1%）和早期自然流產(chǎn)率（11.5% vs 10.8%）比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見(jiàn)表3。4BC 組與4CB 組的妊娠結(jié)局分析顯示，4CB 組的臨床妊娠率顯著高于4BC 組（51.4% vs 39.7%，P=0.013），而生化妊娠率（14.1% vs 11.7%）和早期自然流產(chǎn)率（18.2% vs 18.9%）比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表3。不同級(jí)別的內(nèi)細(xì)胞及滋養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)評(píng)分見(jiàn)圖1。

2.3 優(yōu)質(zhì)囊胚與非優(yōu)質(zhì)囊胚對(duì)妊娠結(jié)局的影響

優(yōu)質(zhì)囊胚組（4AB+4BA）和非優(yōu)質(zhì)囊胚組（4BC+4CB）的妊娠結(jié)局比較顯示，優(yōu)質(zhì)囊胚組的臨床妊娠率顯著高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組（66.6% vs 44.9%）、生化妊娠率（4.4% vs 12.9%）和早期流產(chǎn)率（11.4% vs 18.5%）均顯著低于非優(yōu)質(zhì)囊胚組（P ＜0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分對(duì)妊娠結(jié)局的影響

隨著體外囊胚培養(yǎng)體系的日趨成熟，囊胚培養(yǎng)成為了國(guó)內(nèi)外大部分生殖醫(yī)學(xué)中心的主要胚胎培養(yǎng)技術(shù)之一。在患者的可利用胚胎較多的情況下，臨床醫(yī)師和胚胎學(xué)家會(huì)建議患者進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，以篩選最有種植潛能的胚胎。通過(guò)形態(tài)學(xué)評(píng)分，將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞層的評(píng)分達(dá)到A/B 級(jí)的單個(gè)囊胚作為移植首選，已成為一種提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率的方法[1，7-8]。本研究選取了囊胚腔擴(kuò)張程度為四期的單囊胚復(fù)蘇移植周期，并在移植前擴(kuò)張至四期，排除了囊胚腔擴(kuò)張程度這一干擾因素，可更好的評(píng)價(jià)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞層的重要性。

表1 4AB和4BA單囊胚移植患者基本資料比較

表2 4BC和4CB單囊胚移植患者基本資料的比較

圖1 不同級(jí)別的內(nèi)細(xì)胞及滋養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)（×400）

表3 四組囊胚的妊娠結(jié)局比較[n/n（%）]

3.2 形態(tài)學(xué)評(píng)分相近囊胚的選擇策略

囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞層在胚胎發(fā)育和種植過(guò)程中各司其職，缺一不可。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育為胎兒，滋養(yǎng)細(xì)胞層發(fā)育為胎盤(pán)。在單囊胚移植挑選中，如何選擇形態(tài)學(xué)評(píng)分相近囊胚是臨床醫(yī)師和胚胎學(xué)家面對(duì)的日常問(wèn)題。本研究表明，4AB 和4BA囊胚移植的妊娠結(jié)局相似，兩組臨床妊娠率均達(dá)到較高水平（均＞66%），而生化妊娠率和早期流產(chǎn)率較低。然而，4BC 和4CB 囊胚比較，4CB 囊胚的臨床妊娠率顯著高于4BC 組，并且生化妊娠率和早期流產(chǎn)率相仿。本研究結(jié)果顯示，由于優(yōu)質(zhì)囊胚（4AB和4BA）的整體評(píng)分高，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞層均具有較高的種植潛力，因此4AB 和4BA 兩組的妊娠結(jié)局相似。而對(duì)于非優(yōu)質(zhì)囊胚而言，滋養(yǎng)細(xì)胞層對(duì)臨床妊娠的影響更大，提示滋養(yǎng)細(xì)胞層在囊胚種植早期階段發(fā)揮重要作用相關(guān)。研究表明，只有囊胚種植在子宮內(nèi)膜上，才有可能提供營(yíng)養(yǎng)給胎兒后續(xù)的發(fā)育[9]。目前有關(guān)囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或滋養(yǎng)細(xì)胞層對(duì)預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的價(jià)值存在眾多爭(zhēng)議。國(guó)內(nèi)學(xué)者汪彩珠等[10]報(bào)道在凍融單囊胚移植周期中，當(dāng)囊胚評(píng)級(jí)≥BB 級(jí)時(shí)，因其臨床結(jié)局相似，均可考慮施行單囊胚移植。夏夢(mèng)等[5]的研究表明，相對(duì)于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的級(jí)別，隨著滋養(yǎng)細(xì)胞層評(píng)分增高，臨床妊娠率和活產(chǎn)率顯著增高，而流產(chǎn)率顯著降低；尤其對(duì)于優(yōu)質(zhì)囊胚而言，滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)囊胚種植更重要。Bakkensen 等[7]報(bào)道滋養(yǎng)細(xì)胞層的質(zhì)量與臨床妊娠率和活產(chǎn)率相關(guān)。但亦有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分越高，其囊胚的整倍體率也越高[11]。在新鮮移植周期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分與活產(chǎn)率呈正相關(guān)關(guān)系[6]。

表4 優(yōu)質(zhì)囊胚組和非優(yōu)質(zhì)囊胚組的妊娠結(jié)局比較[n/n（%）]

3.3 優(yōu)質(zhì)囊胚與非優(yōu)質(zhì)囊胚移植的妊娠結(jié)局比較

本研究將復(fù)蘇周期中單個(gè)四期囊胚移植分為兩組：優(yōu)質(zhì)囊胚和非優(yōu)質(zhì)囊胚，發(fā)現(xiàn)囊胚的總體質(zhì)量可預(yù)測(cè)患者的妊娠結(jié)局。優(yōu)質(zhì)的四期囊胚有更高的臨床妊娠率、更低的生化妊娠率和早期流產(chǎn)率?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道均支持相同的觀點(diǎn)，即囊胚整體質(zhì)量顯著影響臨床妊娠率和活產(chǎn)率[12-14]。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞達(dá)到A 或B 級(jí)的囊胚和其中之一為C 級(jí)的囊胚移植后相比，臨床妊娠率和活產(chǎn)率有顯著性提高[15-16]。

3.4 本研究的局限性

本研究仍存在一定的缺陷。首先，所納入的復(fù)蘇周期的單囊胚移植周期數(shù)量較少，仍需要繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入分析；此外，后續(xù)研究需要細(xì)分囊胚的發(fā)育天數(shù)對(duì)妊娠結(jié)局的影響。

綜上所述，囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分是復(fù)蘇周期中具有顯著意義的評(píng)價(jià)臨床妊娠率的預(yù)測(cè)指標(biāo)。對(duì)于非優(yōu)質(zhì)囊胚而言，滋養(yǎng)細(xì)胞層對(duì)囊胚種植潛能具有更重要的臨床意義，可作為預(yù)測(cè)臨床妊娠率的正性相關(guān)指標(biāo)。本研究為復(fù)蘇周期中單囊胚移植在形態(tài)學(xué)評(píng)分相似的情況下提供了選擇依據(jù)。