曹繼敏，李雙財(cái)，何德

·農(nóng)業(yè)生物技術(shù)·

鎘脅迫后旱柳轉(zhuǎn)錄組變化分析

曹繼敏，李雙財(cái)，何德

西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224

隨著重金屬鎘(Cd) 應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，由此引發(fā)的土壤鎘污染問題日益嚴(yán)重。以具有植物恢復(fù)潛力的旱柳作為研究對象，探究不同濃度的Cd (2.5 mg/L, 50 mg/L) 脅迫后旱柳無性系1 d、7 d和30 d后基因表達(dá)與代謝通路的變化。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明：共獲得102 595個(gè)非冗余基因 (Unigenes)，相同濃度不同時(shí)間的差異基因總數(shù)為26 623個(gè)和32 154個(gè)；相同時(shí)間不同濃度的差異基因總數(shù)為8 550個(gè)、3 444個(gè)和11 428個(gè)。從中篩選得到與Cd脅迫響應(yīng)密切相關(guān)的基因25個(gè)，其中金屬硫蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鋅和錳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等基因的表達(dá)不僅會隨著Cd脅迫濃度變化而且同時(shí)受到脅迫時(shí)間的改變而發(fā)生改變；油菜素內(nèi)酯合成通路的ROT3和黃酮類化合物合成通路的FLS、F3H均明顯上調(diào)。此外Cd脅迫引起旱柳在代謝過程、細(xì)胞過程、膜、細(xì)胞器、細(xì)胞、細(xì)胞部分、催化活化和結(jié)合蛋白這8個(gè)方面發(fā)生改變，參與這些GO條目的差異表達(dá)基因數(shù)隨著Cd濃度和脅迫時(shí)間的增加而增加。并對轉(zhuǎn)錄組信息的可靠性用RT-PCR和酶活性生理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了驗(yàn)證。文中通過轉(zhuǎn)錄組測序分析旱柳Cd脅迫后的響應(yīng)機(jī)制，從而為旱柳修復(fù)土壤Cd污染提供理論指導(dǎo)。

旱柳，鎘，轉(zhuǎn)錄組，差異表達(dá)基因

近年來隨著金屬鎘(Cd) 應(yīng)用的擴(kuò)大與加速，Cd污染途徑迅速增多，如工業(yè)廢氣會將Cd帶到氣流層中，并以大氣沉降、降雨以及下雪等方式進(jìn)入土壤中，造成土壤Cd污染；同時(shí)，農(nóng)業(yè)上的污水灌溉以及含Cd藥劑的使用都會使Cd進(jìn)入土壤，從而加重土壤的Cd污染，Cd已成為造成全球污染最主要的重金屬之一。此外土壤中的Cd主要通過根的吸收進(jìn)入植物體內(nèi)，然后與根細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)合，后經(jīng)木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)角o、葉、果實(shí)等器官中積累，抑制植物的生長發(fā)育[1]。Cd可以通過食物鏈進(jìn)入動物和人體內(nèi)，對機(jī)體造成嚴(yán)重傷害。過量Cd積累導(dǎo)致肺紋理增多、紊亂而模糊，白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量增多，引起肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，使肺泡間隔增厚，間質(zhì)纖維增生，也會直接作用于骨骼，使有機(jī)體骨骼礦化發(fā)生障礙、骨鈣溶出的增加以及骨膠原和骨的固化作用異常等[2–3]。20世紀(jì)60年代發(fā)生在日本神通川流域的“骨痛病”，原因就是當(dāng)?shù)鼐用袷秤酶缓亟饘貱d的大米造成的。在我國，土壤Cd污染日益嚴(yán)重，并造成了一系列問題，例如“鎘大米”、農(nóng)作物減產(chǎn)等[4]。

重金屬污染問題亟待解決，但是傳統(tǒng)的物理、化學(xué)修復(fù)的方法存在不可避免的缺陷[5]。例如常用的工程治理法存在成本高昂且工程量大的問題。同時(shí)由此帶來的土壤自身結(jié)構(gòu)破壞問題也不容忽視。電動修復(fù)、土壤淋洗等方法操作復(fù)雜，可行性較差。植物修復(fù)以其成本低、安全可靠、對環(huán)境干擾小且改善生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注[6]，木本植物作為多年生植物不僅有龐大的根系、巨大的生物量、發(fā)達(dá)的維管組織、堅(jiān)固的木質(zhì)組織、高效的蒸騰作用，還具有吸收多種重金屬的優(yōu)勢，成為環(huán)境重金屬污染治理的重要研究對象[7]。旱柳作為一種常見的木本植物，具有生長快、易繁殖、生物量大、根系發(fā)達(dá)、再生能力強(qiáng)和對多種重金屬耐受的特點(diǎn)，在重金屬污染治理方面具有較大的潛力[8-9]。

轉(zhuǎn)錄組測序 (RNA-Seq) 技術(shù)可以研究所有mRNA轉(zhuǎn)錄本的豐度信息，其樣本檢測甚至不以完整基因組序列為前提，能夠發(fā)掘新的轉(zhuǎn)錄本和可變剪接體[10]，且可以得到定量更準(zhǔn)確、分析更可靠、重復(fù)性更高及檢測范圍更廣的結(jié)果[11]。當(dāng)前對旱柳重金屬耐受性的研究主要集中在對重金屬的植物體內(nèi)富集情況的調(diào)查、影響因素、生理變化等方面，對重金屬富集后植物耐受的分子機(jī)理研究較少，尤其在轉(zhuǎn)錄水平上研究很少。旱柳在受重金屬Cd脅迫后，mRNA的表達(dá)水平發(fā)生了重大的變化，因此本研究從轉(zhuǎn)錄水平著手，探究旱柳在Cd脅迫條件下的耐受性反應(yīng)情況，為旱柳修復(fù)土壤Cd污染提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的旱柳枝條均來源于云南省昆明市北京路延長線附近的一株旱柳。截取長度為25 cm的一年生旱柳枝條用改良的霍格蘭德營養(yǎng)液[12]進(jìn)行水培。水培后的旱柳隨機(jī)分成3組(每組5盆，每盆3棵)，1組為對照組，其余2組為實(shí)驗(yàn)組。用Cd (NO3)2對實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行Cd處理，使盆里的Cd濃度分別為2.5 mg/L和 50 mg/L，每3 d換一次營養(yǎng)液。用隨機(jī)混取法采集3組的第0、1、7、30天并處于同一位置的葉片作為研究材料；所有試驗(yàn)葉片采集完成后液氮急速冷凍后放置于?80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。對照組用CK表示， 2.5 mg/L處理組用L表示，50 mg/L處理組用H表示；樣品編號如下：第0天分別為CK0、L0、H0，第1天分別為CK1、L1、H1，第7天分別為CK7、L7、H7，第30天分別為CK30、L30、H30。

1.2 總RNA提取及樣品檢測

總RNA提取按照OMEGA公司的E.Z.N.ATMPlant RNA Kit試劑盒說明書進(jìn)行。獲得的總RNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用液相色譜Agilent 2100和260/280的比值檢測RNA的純度。

1.3 文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序

樣品檢測合格后，加入破碎緩沖液將mRNA打斷成短片段，用六堿基隨機(jī)引物以mRNA為模板合成cDNA第一條鏈，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymeraseⅠ合成cDNA第二條鏈，雙鏈cDNA經(jīng)AMPure XP beads純化后進(jìn)行cDNA的末端修復(fù)、加A尾后連接測序接頭，用AMPure XP bead選擇片段大小，最終cDNA文庫通過PCR富集得到。cDNA文庫質(zhì)量通過Agilent 2100檢測，再經(jīng)深圳華大基因生物科技有限公司的Illumina Hi-Seq2500平臺完成RNA-Seq測序。

1.4 De novo組裝

獲得的原始數(shù)據(jù)(Raw reads) 經(jīng)過濾得到干凈數(shù)據(jù) (Clean reads)。使用Trinity對clean reads組裝得到contigs，之后再用Tgicl對轉(zhuǎn)錄組樣本進(jìn)行兩次聚類去冗余得到最終Unigene。Unigene分為兩部分，一部分是clusters，是進(jìn)一步去冗余后的結(jié)果；其余的是singletons，指沒有聚類、單獨(dú)的Unigene。每個(gè)樣品測序產(chǎn)出不少于6 Gb Clean data，Q30堿基百分比要達(dá)到85%。

1.5 生物信息學(xué)分析

使用BlAST對Unigene序列與Nr、Nt、KOG、KEGG、GO、Swiss-Prot及InterPro數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(E value<1e-5)，獲取與旱柳Unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。

本研究從兩個(gè)角度分析旱柳在Cd脅迫后的差異基因表達(dá)情況：1) 同一時(shí)間不同濃度Cd脅迫的差異基因表達(dá)情況的對比分析，命名為L1-CK1 (即L1和CK1兩個(gè)樣品的基因表達(dá)對比，下同)、H1-CK1、L7-H7、L30-CK30、H30-CK30；2) 同一濃度不同時(shí)間的差異基因表達(dá)情況對比分析，分為2.5 mg/L組和50 mg/L組，命名為L1-CK0、H1-CK0、L7-L1、H7-H1、L30-L7、H30-H7。

使用Blast2GO和WEGO軟件對差異表達(dá)的Unigene進(jìn)行GO功能分類[13]，并將其注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中，之后進(jìn)行pathway分析[14]。最終得到2.5 mg/L和50 mg/L濃度Cd脅迫后不同時(shí)間旱柳的生理生化響應(yīng)結(jié)果。

1.6 差異表達(dá)基因qPCR驗(yàn)證

在BIO-RAD公司的C1000TM熒光定量PCR儀進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，反應(yīng)體系20 μL。以內(nèi)參基因?yàn)閷φ誟15]，利用公式2-△△Ct計(jì)算其相對表達(dá)量。

1.7 抗氧化酶活性測定

植物在受到重金屬脅迫后，會通過調(diào)動各種酶來保護(hù)自身機(jī)體，因此植物抗氧化酶的酶活性變化是一個(gè)非常重要的反映植物生理狀態(tài)與抗逆性的指標(biāo)。為驗(yàn)證旱柳鎘脅迫后轉(zhuǎn)錄組信息的可靠性，對旱柳的SOD、POD、CAT的酶活性進(jìn)行了測定[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序與De novo組裝

9個(gè)樣品的raw reads數(shù)在72.22 Mb到85.59 Mb之間，過濾后的總clean reads在65.17 Mb到67.15 Mb之間；Q20、Q30以及過濾前后的reads的比率分別為95.04%到97.38%，86.40%到90.91%，72.75%到89.4% (表1)，這說明低質(zhì)量的堿基比率低，測序質(zhì)量好，可以用于下一步的組裝。使用Trinity對其進(jìn)行組裝，所有樣品的總reads數(shù)均超過10萬，總長度超過7 000萬，平均長度超過600，N50超過1 000，GC含量42%左右。接下來使用Tgicl對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類去冗余得到Unigene，聚類后的Unigene質(zhì)量見表2，10個(gè)樣品的Unigene數(shù)為53 705個(gè)到62 933個(gè)，總長度從43 247 382 nt 到50 853 969 nt，N50值都在 1 200之上，這表明組裝質(zhì)量高，可用于后續(xù)分析。

2.2 對Unigene的功能注釋

得到的Unigene有83.93%能在7個(gè)數(shù)據(jù)庫(Nr、Nt、KOG、KEGG、GO、Swiss-Prot及InterPro)中任意一個(gè)注釋到，其中Nt數(shù)據(jù)庫注釋到的Unigenes最多，占所有Unigenes的81.12%，但被全部數(shù)據(jù)庫注釋到的Unigenes僅為29.04%，表明有許多旱柳Unigenes的功能還沒有完全明確。Nr數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果進(jìn)行篩選，篩選條件為E值小于10?5，結(jié)果顯示有74 919條Unigenes在Nr數(shù)據(jù)庫中找到了同源蛋白序列，占總Unigenes數(shù)的73.02%。

2.3 差異表達(dá)基因分析

FDR (False discovery rate) 值越小，表明基因表達(dá)差異越大，差異越顯著。本研究在篩選差異表達(dá)基因時(shí)設(shè)置的閾值為Fold Change≥2.00、FDR≤0.001、Q-value<0.05。

表1 過濾前后的reads質(zhì)量統(tǒng)計(jì)表

表2 Unigene的質(zhì)量指標(biāo)

根據(jù)表3可知，相同時(shí)間不同濃度的差異表達(dá)基因 (Differentially expressed genes，DEG) 分析表明：第1天組(L1-CK1和H1-CK1) 中的差異基因數(shù)為8 550個(gè)(3 660個(gè)上調(diào)和4 890個(gè)下調(diào))；第7天組(L7-H7) 的差異基因數(shù)為3 444個(gè)(1 307個(gè)上調(diào)和2 137個(gè)下調(diào))；第30天組(L30- CK30和H30-CK30) 中的差異基因數(shù)為11 428個(gè)(5 055個(gè)上調(diào)和6 373個(gè)下調(diào))。相同濃度不同時(shí)間的DEG分析表明：2.5 mg/L組(L1-CK0、L7-L1、L30-L7) 中的差異基因數(shù)為26 623個(gè) (14 531個(gè)上調(diào)和12 092個(gè)下調(diào)；50 mg/L組(H1-CK0、H7-H1、H30-H7) 中的總差異基因數(shù)為32 154個(gè)(18 318個(gè)上調(diào)和13 836個(gè)下調(diào))，這表明50 mg/L濃度的鎘脅迫比2.5 mg/L的對旱柳的影響更加明顯，這些差異表達(dá)基因可能在脅迫過程中起關(guān)鍵作用。此外，在L1-CK1、H1-CK1、L30-CK30和H30-CK30這4組中有共同的170個(gè)DEG (其中46個(gè)共同上調(diào)和29個(gè)共同下調(diào))，它們的基因表達(dá)量差異達(dá)2倍 (|Log2ration|≥1)以上。170個(gè)DEG中又有25個(gè)其表達(dá)量差異是大于1 000倍 (|Log2ration|≥10)以上的，其中19個(gè)是上調(diào)，6個(gè)下調(diào)(表4)。金屬硫蛋白基因、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族、鋅和錳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的基因表達(dá)會隨著Cd濃度的增高和脅迫時(shí)間的增加而有較大的變化，L7-L1、L30-L7、H7-H1、H30-H7組中金屬硫蛋白共9個(gè)上調(diào)、11個(gè)下調(diào)；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族共90個(gè)上調(diào)、88個(gè)下調(diào)，其中H30-H7中32個(gè)上調(diào)、50個(gè)下調(diào)；鋅和錳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族有28個(gè)下調(diào)、8個(gè)上調(diào)，這些結(jié)果表明旱柳在應(yīng)對Cd脅迫的過程中金屬硫蛋白基因、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族及鋅和錳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起了很大的作用，也說明Cd脅迫會影響旱柳對其他金屬離子的吸收，鋅和錳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量的變化可能是因?yàn)镃d在生命體內(nèi)會置換鋅，導(dǎo)致生命體需鋅的蛋白質(zhì)發(fā)生“饑餓”，為了生命正?；顒拥倪M(jìn)行，旱柳加快了鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，從而使鋅、錳蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的表達(dá)發(fā)生變化。

2.4 Unigene GO功能分類

根據(jù)Nr數(shù)據(jù)庫注釋的信息結(jié)果顯示，有51 494條Unigene 映射到GO不同的功節(jié)點(diǎn)(Term)上，根據(jù)生物過程(Biological process)、細(xì)胞組成(Cellular component)、分子功能(Molecular function)進(jìn)行分類。由于經(jīng)常有同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本映射到不同節(jié)點(diǎn)現(xiàn)象，所以在生物過程中有106 517條，占42.69%，參與代謝過程(Metabolic process) (22 955，21.54%)、細(xì)胞過程(Cellular process) (21 034，19.75%)的Unigene最多；在細(xì)胞組成中有92 900條，占37.24%，參與膜(Membrane) (15 182，16.34%)、細(xì)胞器(Organelle) (13 010，14.01%)、細(xì)胞(Cell) (16 820，18.11%) 和細(xì)胞部分(Cell part) (16 671，17.95%) 的Unigene最多；在分子功能中有50 054條，占20.06%，參與催化活性(Catalytic activity) (20 318，40.59%) 和結(jié)合蛋白(Binding) (20 533，41.02%) 的Unigene最多(圖1)。

表4 抗逆相關(guān)基因詳細(xì)情況

2.5 Unigne的KEGG注釋和代謝通路分析

將旱柳差異表達(dá)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，53 966個(gè)Unigene注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫的6個(gè)一級層級和21個(gè)二級層級中，共包含137條通路。其中在同一個(gè)通路中10個(gè)以上差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、代謝以及有機(jī)系統(tǒng)6個(gè)方面。這6個(gè)方面中代謝類的涉及最多，包括碳水化合物、氨基酸、多糖生物合成、能量、次生物質(zhì)等；涉及人類疾病的最少，僅僅只有2個(gè)，為“內(nèi)分泌和代謝性疾病” (Endocrine and metabolic diseases) 和耐藥性：抗菌素(Drug resistance：Antimicrobial)。旱柳Cd脅迫后KEGG分析中有涉及人類疾病的基因發(fā)生變化，這也說明Cd對旱柳當(dāng)中有關(guān)涉及人類疾病的內(nèi)分泌和抗菌素的代謝有影響。同時(shí)，pathway富集結(jié)果也顯示，前述的25個(gè)Cd脅迫響應(yīng)候選基因主要參與代謝途徑(Metabolic pathway) (10 541，19.53%)、次級代謝產(chǎn)物的合成(Synthesis of secondary metabolites) (5 473，10.14%)、植物MAPK信號通路(Plant MAPK signaling pathway) (1 592，2.95%)、植物病原互作(Plant pathogen interaction) (1 761，3.26%)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction) 等通路(1 862，3.45%) (表5)。由此推測旱柳可能主要是通過這些代謝通路調(diào)控Cd抗逆性過程。

圖1 Unigene的GO分類圖

2.6 差異基因的qPCR

從25個(gè)旱柳Cd脅迫響應(yīng)候選基因中選擇在代謝通路中顯著上升的3個(gè)(黃酮類化合物生物合成和油菜素內(nèi)酯合成的關(guān)鍵基因：flavonoid synthase (FLS) (Unigene3229_All)、flavanone-3-hydroxylase (F3H) (CL11387.Contig1_All)和3-epi-6- deoxocathasterone 23-monooxygenase (ROT3) (CL1644.Contig4_All) 基因和1個(gè)calcium- dependent protein kinase 2 (CL13372.Contig3_All) 共同下調(diào)基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序分析的準(zhǔn)確性和可靠性，以肌動蛋白基因() (CL10874.Contig2_All) 為內(nèi)參基因。圖2–6的qPCR結(jié)果顯示，4個(gè)差異表達(dá)基因在轉(zhuǎn)錄組測序中的表達(dá)變化與熒光定量結(jié)果基本一致，說明轉(zhuǎn)錄組測序分析的結(jié)果真實(shí)可靠。

圖4 CL1644.Contig4_All基因qPCR結(jié)果

圖5 CL13372.Contig3_All基因qPCR結(jié)果

2.7 抗氧化酶活性

根據(jù)表6可知，在鎘脅迫條件下，旱柳在7 d之前(包括第7天) 會因?yàn)殒k的脅迫而導(dǎo)致其SOD的活性下降，而到了第30天，它們的活性會超過對照組，達(dá)到顯著水平(<0.05)。這可能是由于旱柳的保護(hù)酶在應(yīng)對鎘脅迫過程中需要一段時(shí)間的適應(yīng)。旱柳POD活性會隨著鎘脅迫時(shí)間的延長而出現(xiàn)上升-下降-上升的趨勢。根據(jù)表7可知，其基因表達(dá)也是如此，CAT的表達(dá)量受鎘脅迫的影響較少，僅有個(gè)位數(shù)的CAT基因表在受到鎘脅迫后發(fā)生改變，但對其活性影響較大，這可能是由于鎘影響旱柳細(xì)胞環(huán)境造成CAT活性改變而引起的在鎘的脅迫下。旱柳的SOD活性和基因表達(dá)量會隨著脅迫時(shí)間的增加而出現(xiàn)先下降在上升的趨勢；POD的活性和基因表達(dá)量會隨著 脅迫時(shí)間的增加而出現(xiàn)上升-下降-上升的趨勢；鎘對CAT的活性影響較大，但對基因表達(dá)影響卻不大。

圖6 CL10874.Contig2_All基因qPCR結(jié)果

表6 不同鎘濃度脅迫及其脅迫時(shí)長對旱柳SOD、POD、CAT活性影響

Different lowercase letters indicate significant difference (<0.05), and the same letter or no letter indicates that the difference is not significant (>0.05).

3 討論

近年來對植物響應(yīng)重金屬脅迫后的基因表達(dá)研究已取得不少成果，鑒定和推測出不少關(guān)于重金屬響應(yīng)的基因，包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族、鋅和錳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族、重金屬ATP酶(HMAs) 家族、陽離子擴(kuò)散促進(jìn)者(CDF) 家族、植物螯合肽合成基因(PCS)、金屬硫蛋白基因(MT) 和金屬忍耐蛋白基因(MTP)等[17]。金屬硫蛋白基因?qū)τ诩?xì)胞內(nèi)重金屬離子以及自由基的清除具有重要的作用，無論Cd誘導(dǎo)與否，金屬硫蛋白基因在杞柳體內(nèi)表達(dá)量均很高，前人研究表明杞柳[18]葉片中金屬硫蛋白基因在Cd脅迫條件下表達(dá)上調(diào)。旱柳響應(yīng)Cd脅迫的過程中，金屬硫蛋白基因表達(dá)會隨著Cd濃度的增高和脅迫時(shí)間的增加而上調(diào)。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族基因表達(dá)量發(fā)生明顯變化，說明旱柳在Cd脅迫響應(yīng)中細(xì)胞物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)主要是通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白來實(shí)現(xiàn)的，也說明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族在旱柳細(xì)胞運(yùn)送重金屬相關(guān)物質(zhì)中起重要作用。杞柳在Cd脅迫條件下反應(yīng)與旱柳基本一致，其中在生物學(xué)過程中分布最多的是細(xì)胞學(xué)過程、代謝過程和環(huán)境響應(yīng)相關(guān)的基因。在分子功能大類中大部分基因與結(jié)合、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)子活性相關(guān)、細(xì)胞組分中主要集中在細(xì)胞、細(xì)胞分區(qū)以及細(xì)胞器相關(guān)的基因。

旱柳在高鹽脅迫下表現(xiàn)出與重金屬脅迫不同的反應(yīng)模式，研究表明高鹽脅迫主要影響的是旱柳細(xì)胞途徑、遺傳信號響應(yīng)、環(huán)境信號響應(yīng)、新陳代謝和生物系統(tǒng)5個(gè)方面；其中包括碳水化合物、氨基酸、多糖生物合成、能量、次生物質(zhì)等新陳代謝類最大，生物系統(tǒng)類是最小的。鎘脅迫主要影響的是細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、代謝以及有機(jī)系統(tǒng)6個(gè)方面；其中代謝類的涉及最多，包括碳水化合物、氨基酸、多糖生物合成、能量、次生物質(zhì)等；涉及人類疾病的最少，僅僅只有2個(gè)。鹽脅迫差異基因主要參與的核糖體、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉蔗糖代謝、碳代謝以及植物病原菌的相互作用等通路[19]，鎘脅迫差異基因主要參與代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的合成、植物MAPK信號通路、植物病原互作、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路。

旱柳在受高鹽脅迫后，其不定根展現(xiàn)出與不同的抗性機(jī)制來對抗鹽脅迫，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長SOS系統(tǒng)的負(fù)調(diào)因子基因編碼GI蛋白持續(xù)下調(diào)，說明SOS系統(tǒng)的活性在不斷增強(qiáng)。參與ROS清除的基因包括過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族蛋白、SRO5蛋白等。說明旱柳不定根通過啟動SOS系統(tǒng)與ROS清除系統(tǒng)兩套機(jī)制來對抗鹽脅迫[20]。旱柳鎘脅迫后與其一致。

黃酮類化合物是植物體內(nèi)一類在抗菌、抗逆性上具有重要的作用的化合物，是一種良好的抗氧化劑，能夠清除生物膜周圍和細(xì)胞內(nèi)的H2O2[21-22]。有研究表明，黃酮化合物的代謝通路在水稻響應(yīng)Cu2+和Cd2+的脅迫以及組培旱柳苗響應(yīng)Cd2+中起了積極作用[23-24]。孫愛清等[25]的研究發(fā)現(xiàn)干旱也會對類黃酮代謝相關(guān)基因的表達(dá)量產(chǎn)生影響，而本研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫同樣提高了旱柳黃酮類相關(guān)基因的表達(dá)量，這些結(jié)果充分說明黃酮類代謝相關(guān)基因在植物發(fā)揮抗逆性的過程中產(chǎn)生重要作用。

同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)油菜素內(nèi)酯合成通路的(ROT3) 在除L1-CK1外，在其他樣品中都是上調(diào)。本研究的結(jié)果與靳開川等[26]的研究結(jié)果一致，旱柳在受Cd脅迫后ROT3基因顯著上調(diào)，而他們結(jié)合遺傳學(xué)、基因與蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等多學(xué)科方法和手段，研究發(fā)現(xiàn)多種極端環(huán)境(干旱、高鹽、高溫、低溫、重金屬) 均影響油菜素內(nèi)酯在植物中的含量，充分表明了ROT3在植物發(fā)揮抗逆性過程中不可或缺。王喆等[27]研究表明油菜素內(nèi)酯可能會與膜蛋白結(jié)合，然后通過減輕重金屬脅迫來提高代謝活性，從而降低植物對重金屬的攝取能力[28]。本文對旱柳受Cd脅迫的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了差異基因的分析，找到了受脅迫的相關(guān)基因以及與之相關(guān)的代謝通路，但這些基因是如何互相作用調(diào)節(jié)旱柳Cd脅迫，還需要在分子方面進(jìn)行更加深入的分析。

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Transcriptome analysis ofunder cadmium stress

Jimin Cao, Shuangcai Li, and De He

College of Life Sciences, Southwest Forestry University, Kunming 650224,Yunnan, China

With the expanded application of heavy metal cadmium, soil cadmium pollution is more and more serious. In this study, usingas a phytoremediation candidate, we observed changes of gene expression and metabolic pathway after 1, 7 and 30 days under 2.5 mg/L and 50 mg/L cadmium stress. The result of transcriptome sequencing showed that we obtained 102 595 Unigenes; 26 623 and 32 154 differentially expressed genes (DEG) in the same concentration and different stress time; 8 550, 3 444 and 11 428 DEG with different concentrations at the same time; 25 genes closely related to cadmium stress response were screened. The changes of genes expression (such as metallothionein, ABC transporter, zinc and manganese transporter) depended on both concentration of cadmium and exposure time. The expression of several genes was obviously up-regulated after cadmium stress, for example 3,6-deoxyinosinone ketolase (ROT3) in brassinolide synthesis pathway and flavonoid synthase (FLS), flavanone-3-hydroxylase (F3H) in the synthesis pathway of brassinolide. In addition, GO analysis shows that GO entries were mainly enriched in metabolic processes including cellular processes, membranes, membrane fractions, cells, cellular fractions, catalytic activation and binding proteins in response to cadmium stress, whose number would increase along with cadmium concentration and exposure time. The reliability of transcriptome information was verified by qPCR and physiological experimental data. Response mechanisms ofafter cadmium stress were analyzed by transcriptome sequencing, which provided theoretical guidance for remediation of cadmium pollution in soil by.

, cadmium, transcriptome, differentially expressed genes

10.13345/j.cjb.190486

October 30, 2019;

March 5, 2020

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31260041), First-level Discipline Construction Project of Yunnan Province’s Advantageous Key Disciplines (No. 50097505), Scientific and Technological Innovation for the Protection and Utilization of Undergrowth Biological Resources in Southern Universities (No. 51400605).

De He. E-mail: 1419615009@qq.com

國家自然科學(xué)基金 (No. 31260041)，云南省優(yōu)勢特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目 (No. 50097505)，云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新 (No. 51400605) 資助。

曹繼敏, 李雙財(cái), 何德. 鎘脅迫后旱柳轉(zhuǎn)錄組變化分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(7): 1365–1377.

Cao JM, Li SC, He D. Transcriptome analysis of Salix matsudana under cadmium stress. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1365–1377.

(本文責(zé)編 郝麗芳)