董基

（肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶，526061）

0 引 言

谷物糧食是中國(guó)傳統(tǒng)膳食的主體，是人體理想的能量來源，還富含多種礦物質(zhì)、B 族維生素和膳食纖維。以谷物和牛奶混合發(fā)酵制得的谷物酸奶，既提升了產(chǎn)品的口感和外觀，還增加了酸奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，使其更受消費(fèi)者的歡迎。伏馬毒素(fumonisin，F(xiàn)B)是由輪狀鐮刀菌、串珠鐮刀菌等在合適的環(huán)境下生成的類真菌毒素，是由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物，對(duì)人體具有急性毒性及潛在的致癌性[1-3]。常見的伏馬毒素有伏馬毒素B1( fumonisin B1，F(xiàn)B1) 、伏馬毒素B2( fumonisin B2，F(xiàn)B2) 和伏馬毒素B3( fumonisin B3，F(xiàn)B3)，其中以FB1毒性最大[4-6]，在自然條件下，伏馬毒素主要污染糧食谷物產(chǎn)品，若采用被伏馬毒素污染的谷物生產(chǎn)酸奶，可能造成整個(gè)產(chǎn)品的污染。目前針對(duì)谷物酸奶中的真菌毒素檢測(cè)，主要是黃曲霉毒素類[7-9]，關(guān)于酸奶中伏馬毒素的研究報(bào)道較少，所以有必要建立一種針對(duì)谷物酸奶中伏馬毒素的檢測(cè)方法，對(duì)評(píng)價(jià)此類食品的安全具有重要意義。

目前伏馬毒素的研究主要集中在FB1的分析檢測(cè)，有高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS /MS）[10-15]。高效液相色譜法應(yīng)用較為廣泛，檢測(cè)穩(wěn)定性較好，但樣品中基質(zhì)易對(duì)伏馬毒素產(chǎn)生干擾，前處理過程繁瑣，且采用的免疫親和柱成本較昂貴[16-19]。本研究運(yùn)用QuEChERS 技術(shù)的凈化特性，簡(jiǎn)化提取過程，嘗試建立了QuECh-ERS 凈化技術(shù)結(jié)合HPLC-MS /MS 法檢測(cè)谷物酸奶中3 種伏馬毒素( FB1、FB2和FB3) 的方法，方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，降低了檢測(cè)成本，可為谷物酸奶中伏馬毒素的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260 型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司；6460型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司。

FB1溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(100 μg/mL，lot:228012)，F(xiàn)B2溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(100 μg/mL，lot:228034)，F(xiàn)B3溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(100 μg/mL，lot:228038)購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；甲醇、乙腈，均為色譜純，德國(guó)Merck 公司產(chǎn)品；甲酸、乙酸，均為色譜純，上海安譜公司產(chǎn)品。

1.2 樣品來源

樣品均為隨機(jī)購(gòu)買于市場(chǎng)上銷售的谷物酸奶。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex-C18柱(2.1mm×100mm，1.7 μm)；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸溶液，B 為甲醇，梯度洗脫程序?yàn)?～1.0 min，10%～90% B；1.0～5.0 min，90% B；5.0～6.0 min，90%～10% B；6.0～10.0 min，10% B；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧正離子掃描；監(jiān)測(cè)方式：MRM-IDA-EPI；IDA 參數(shù)：1000 CPS 觸發(fā)啟動(dòng)，采用動(dòng)態(tài)背景扣除模式；EPI 參數(shù)：掃描速度10 000 Da/s，掃描范圍（m/z）50～900Da；EPI碰撞能量：20、35 eV。

1.3.3 樣品的提取與凈化

稱取2.5 g（精確至0.001 g）樣品置于50 mL 離心管中，加入10 mL 提取溶液，漩渦混勻30 s，振蕩1.0 h，再加入鹽析劑6.0 g，振蕩1 min，5 000 r/min 離心5 min。取2.0 mL 上清液于離心管中，加入凈化劑后渦旋10 s，離心取上清液，過膜后上機(jī)進(jìn)樣分析。實(shí)驗(yàn)分別比較不同的鹽析劑、提取溶液以及凈化劑組合，對(duì)3種伏馬毒素檢測(cè)的影響。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

吸取10 μL 的3 種伏馬毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容到10.0 mL 配制成100.0 ng/mL 的中間液，再配制成1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、50.0 ng/mL 一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)儀器進(jìn)行分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 方法的精密度、重復(fù)性與回收率

以未檢出3 種伏馬毒素的谷物源性運(yùn)動(dòng)食品為空白基質(zhì)，加入不同濃度的FB1、FB2、FB3混合標(biāo)液，使用QuEChERS提取后，上機(jī)檢測(cè)計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 QuEChERS前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 鹽析劑的選擇

QuEChERS 前處理試劑中的鹽析劑多采用氯化鈉、醋酸鈉、無水硫酸鎂、檸檬酸鈉、檸檬酸鈉二水合物和檸檬酸氫二鈉鹽倍半水合物等。對(duì)谷物中FB 檢測(cè)的研究發(fā)現(xiàn)[7]，采用了無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉二水合物和檸檬酸氫二鈉鹽倍半水合物，質(zhì)量比為4∶1∶1∶0.5，提取效果良好，故試驗(yàn)選擇了該比例混合試劑作為提取劑。

2.1.2 提取溶液的選擇

由于伏馬菌素有較強(qiáng)的極性，會(huì)對(duì)提取溶液的極性表面產(chǎn)生較大的親和力，因此需要高極性的溶劑作為提取溶液[20]。本實(shí)驗(yàn)分別配制4 種提取溶液，提取溶液Ⅰ：甲醇/水（90/10，v/v）、提取溶液Ⅱ：甲醇/水（80/20，v/v）、提取溶液Ⅲ：乙腈/水（90/10，v/v）、提取溶液Ⅳ：乙腈/水（80/20，v/v），分別提取加標(biāo)樣品中的伏馬毒素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以樣品中3 種伏馬毒素的加標(biāo)回收率來比較提取溶液效果。

圖1 4種提取溶液對(duì)伏馬毒素回收率的影響

結(jié)果如圖1所示，提取溶液Ⅲ∶乙腈/水（90/10，v/v）的提取效果最優(yōu)，樣品加標(biāo)回收率最高，這可能與伏馬毒素的極性化合物性質(zhì)有關(guān)，在此比例的提取溶液條件下，目標(biāo)物在提取液中的分配系數(shù)高。且實(shí)驗(yàn)中提取溶液Ⅲ與試樣比為2∶1（mL：g）時(shí)，加入鹽析劑樣品高速均質(zhì)后不易產(chǎn)生乳濁液，上層提取液易過濾分層，比較適合進(jìn)行下步的實(shí)驗(yàn)方案。

2.1.3 凈化劑的優(yōu)化

QuEChERS 前處理技術(shù)常用的凈化劑有PSA、GCB、C18、NH2、中性氧化鋁、弗羅里硅土、SiO2。本試驗(yàn)考察了不同凈化劑以及不同添加量對(duì)回收率的影響。結(jié)果顯示，C18、NH2、弗羅里硅土和SiO2為較優(yōu)凈化劑，如圖2所示。

試驗(yàn)還比較了SiO2+C18、NH2+C18和弗羅里硅土+C18共3 種QuEChERS 凈化劑組合，以提高目標(biāo)物的響應(yīng)值。

結(jié)果見圖3，試驗(yàn)表明30 mg SiO2+30 mg C18+150 mg MgSO4和30 mg 弗羅里硅土+30 mg C18+150 mg MgSO4兩組對(duì)FB1、FB2、FB3響應(yīng)值較高，前者的平均回收率更高，所以本試驗(yàn)選擇了30 mg SiO2+30 mg C18+150 mg MgSO4組合作為凈化劑。

2.2 流動(dòng)相的選擇

伏馬毒素屬于極性化合物，因此流動(dòng)相以水和乙腈作為基礎(chǔ)溶劑，為了促進(jìn)樣品的離子化，本實(shí)驗(yàn)比較了流動(dòng)相中加入0.1 %甲酸、0.1 %乙酸和10 mmol/L乙酸銨，對(duì)3 種伏馬毒素分離效果的影響。結(jié)果表明，加入甲酸時(shí)的離子豐度最強(qiáng)，因此最終確定在流動(dòng)相中添加0.1 %甲酸進(jìn)行梯度洗脫，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜如圖4所示。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

用質(zhì)量濃度為50 ng /mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜掃描，并優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。依據(jù)目標(biāo)物的分子式和碎片離子信息擬合出理論精確質(zhì)量數(shù)。3 種化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1，包括目標(biāo)物的母離子精確質(zhì)量數(shù)，碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)以及去簇電壓和錐孔電壓參數(shù)。

圖2 不同凈化劑對(duì)伏馬毒素回收率的影響

圖3 經(jīng)不同凈化劑組合處理后3種伏馬毒素的回收率比較

2.4 定性方法的確認(rèn)

在檢測(cè)過程中，一般以離子對(duì)“出峰”即為檢出，即為陽性結(jié)果，但在實(shí)際檢測(cè)過程中由于基質(zhì)的復(fù)雜和干擾較大，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，進(jìn)而影響篩查結(jié)果的正確性和篩查報(bào)告的嚴(yán)謹(jǐn)性。本研究利用HPLC-MS /MS 的MRM-IDA-EPI 監(jiān)測(cè)模式，使伏馬毒素在出峰時(shí)，一旦響應(yīng)超過預(yù)設(shè)的數(shù)值，便自動(dòng)觸發(fā)增強(qiáng)子離子掃描模式( EPI)，能夠得到更低濃度化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖，該譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖比對(duì)，可進(jìn)行更準(zhǔn)確的陽性判別。

圖4 伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖

表1 3種伏馬毒素的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)

2.5 方法的線性范圍與靈敏度

在乙腈-0.1%甲酸流動(dòng)相體系中，以梯度洗脫的步驟，按1.3.4 實(shí)驗(yàn)步驟配制3 種伏馬毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:3 種伏馬毒素在1.0 ng/mL ～50.0 ng/mL 內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，線性方程分別為：FB1,Y=3125X＋696，F(xiàn)B2,Y=2373X＋764，F(xiàn)B3,Y=1784X-632；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，計(jì)算得到3種伏馬毒素的LOD均為0.3～0.5 μg/kg，LOQ 為1.0～1.5 μg/kg，結(jié)果見表2。

表2 3種伏馬毒素的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.6 方法的精密度、重復(fù)性與回收率

在加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，選用大麥基質(zhì)、薏仁基質(zhì)、燕麥基質(zhì)、玉米基質(zhì)4 種空白基質(zhì)的樣品，分別添加10 μg/kg、50 μg/kg 和100 μg/kg、中、高的三個(gè)水平混合標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)結(jié)果測(cè)定5 次，進(jìn)行加標(biāo)回收的試驗(yàn)。

由表3 可見，在4 種不同的谷源性基質(zhì)樣品中，3種伏馬毒素(FB1、FB2、FB3)的回收率為84.2%～104%，精密度為2.11%～5.02%，說明本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和精密度可行。

表3 方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

3 結(jié) 論

本文建立了一種QuEChERS-HPLC-MS /MS檢測(cè)谷物酸奶中3 種伏馬毒素的分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品經(jīng)乙腈/水（90/10，v/v）進(jìn)行提取后，經(jīng)30 mg SiO2+30 mg C18+150 mg MgSO4組合凈化劑處理后，可有效去除谷物酸奶中的干擾物對(duì)目標(biāo)峰的影響，實(shí)現(xiàn)對(duì)3 種伏馬毒素的凈化，在質(zhì)譜檢測(cè)器MRM-IDA-EPI 監(jiān)測(cè)模式下，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)谷物酸奶中FB1、FB2和FB33 種伏馬毒素的定性和定量分析。在4 種不同谷源性酸奶基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為84.2%～104%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 在2.11%～5.02%之間，所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度，能準(zhǔn)確快速有效地檢測(cè)谷物酸奶中的3 種伏馬毒素的含量，可為谷物酸奶中FB1、FB2和FB3的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。