陳宏炬，郭 平，林惠真，張 威，葉少清，陳啟振，曾勇明，劉國(guó)坤，吳德印

(1.廈門市普識(shí)納米科技有限公司，福建 廈門 361005；2.廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361005；3.江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西 南昌 330000；4.廈門大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，福建 廈門 361005)

隨著生活水平的提高，人們?cè)絹碓疥P(guān)注飲食的安全問題。近年來，食品安全問題事件頻頻發(fā)生，其中超標(biāo)使用食品添加劑、非法添加化學(xué)物質(zhì)甚至有毒物質(zhì)的情況尤為突出。人工合成色素由于價(jià)格低、著色強(qiáng)，被生產(chǎn)者廣泛使用。市面上常見的五顏六色的糖果、顏色誘人的飲料等大多都添加了人工色素。但幾乎所有的合成色素都不能向人體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),某些合成色素會(huì)危害人體健康,誘發(fā)中毒甚至癌癥,故不能多用或盡量不用[1-2]。人工合成的色素大多為偶氮類化合物，在人體內(nèi)會(huì)分解為芳香胺類化合物，對(duì)人體的危害極大。國(guó)家對(duì)違法濫用人工色素行為嚴(yán)厲打擊，出具了相應(yīng)的法律法規(guī)約束、杜絕這種行為，我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[3]中明確規(guī)定了在我國(guó)允許添加食用色素的適用范圍和限量。

赤蘚紅即是人工合成色素中的一種，紅色或紅褐色的顆?；蚍勰?，色澤鮮艷，著色力好，穩(wěn)定性好，成本低廉，常用于食品加工制品和飲料中，以提高其感官性。部分廠家為了改變產(chǎn)品外觀，吸引消費(fèi)者購(gòu)買，濫用赤蘚紅色素。

目前，赤蘚紅的檢測(cè)方法主要有共振瑞利散射法[4]、免疫PCR法[5]，毛細(xì)管電泳法[6]、分光光度法[7-8]、高效液相色譜法(HPLC)[9-11]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]等。一般來說，用HPLC法檢測(cè)赤蘚紅時(shí)，首先要用固相萃取方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理后，然后才能用高效液相色譜法檢測(cè)食品中的色素[14-16]，所以用色譜法檢測(cè)具有操作步驟復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)、所用試劑種類多且多為有毒的有機(jī)試劑，不利于檢測(cè)人員進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等缺點(diǎn)。拉曼光譜是一種散射光譜，能反映物質(zhì)本身結(jié)構(gòu)特征，具有指紋識(shí)別能力。表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù)是基于待測(cè)分子吸附在具有納米結(jié)構(gòu)的金屬表面之后具有極強(qiáng)的拉曼散射增強(qiáng)效應(yīng)的分子振動(dòng)光譜技術(shù)。該技術(shù)具有前處理簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[17]。

本文中，筆者基于表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，采用納米金溶膠作為增強(qiáng)試劑，對(duì)飲料樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單前處理后，直接進(jìn)行SERS檢測(cè)并利用智能算法分析給出檢測(cè)結(jié)果。該方法檢測(cè)時(shí)間短、步驟簡(jiǎn)單、靈敏度高，特別適用于飲料中赤蘚紅的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

PERS-F便攜式拉曼光譜儀(激發(fā)光波長(zhǎng)785 nm，光譜范圍175～3 200 cm-1，積分時(shí)間2～5 s，激光功率500 mM)，廈門市普識(shí)納米科技有限公司；Milli-Q 超純水儀，美國(guó) Millipore 公司；電子天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；萃取材料弗羅里硅土(平均粒徑150～250 μm，平均孔徑8 nm)和C18(平均粒徑2.7 μm，平均孔徑9 nm，未封尾)，博納艾杰爾公司。

乙醇(分析純)、甲醇(分析純)、乙腈(分析純)、乙酸銨(分析純)，赤蘚紅(純度≥99%)、聚酰胺粉(柱層析0.075～0.15 mm)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；團(tuán)聚劑ZJ-3、增強(qiáng)試劑CP-1,自制，合成方法：將200 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的HAuCl4水溶液加熱至沸騰，迅速加入1.4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸鈉水溶液，約1 min后溶液顏色從先前的淡黃色變成黑色，2～3 min后又變成棕紅色，繼續(xù)保持微沸40 min，停止反應(yīng)，水浴冷卻后，即得到金納米粒子粒徑約為55 nm的棕紅色納米金溶膠。透射電子顯微鏡表征結(jié)果見圖1。

圖1 納米金電鏡圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和SERS檢測(cè)

稱取赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用超純水溶解在10 mL棕色容量瓶中定容，再用水稀釋成0.01～10.0 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液備用。

取200 μL納米金溶膠，加入50 μL團(tuán)聚劑ZJ-3，再加入50 μL不同濃度的赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后進(jìn)行檢測(cè)(積分時(shí)間均為5 s)。

1.2.2 實(shí)際樣品的前處理和SERS檢測(cè)

樣品前處理。分別取適量濃度的赤蘚紅溶液，用西瓜汁稀釋定容至10 mL，分別得到10、5、1、0.5、0.1 和0.05 mg/kg的赤蘚紅加標(biāo)飲料。然后，取5 mL飲料至填充有0.5 cm聚酰胺粉和0.1 cm弗羅里硅土吸附劑的固相萃取(SPE)柱內(nèi)，分別用1 mL水和1 mL乙醇淋洗1次，再用1 mL 5%乙酸銨洗脫，收集洗脫液作為待測(cè)液備用。

赤蘚紅的檢測(cè)。取200 μL納米金溶膠到SERS孔板中，加入50 μL團(tuán)聚劑ZJ-3，再加入50 μL待測(cè)溶液，混勻后在拉曼光譜儀上采集譜圖(為減少分析時(shí)間且達(dá)到快速檢測(cè)的目的，積分時(shí)間在2～5 s間調(diào)整)。

2 結(jié)果與討論

2.1 赤蘚紅的標(biāo)準(zhǔn)SERS譜圖

用SERS技術(shù)對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2(a)所示。由圖2(a)可知，在200 μL納米金溶膠中不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)赤蘚紅的SERS光譜圖上可清晰看到473、619、1 168、1 275、1 334和1 608 cm-1等處的尖銳譜峰，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低至1 mg/kg以下時(shí)，這些譜峰的拉曼強(qiáng)度迅速降低。譜線blank為團(tuán)聚劑ZJ-3的SERS光譜圖，由此可知，ZJ-3分子與納米金溶膠結(jié)合未產(chǎn)生明顯的拉曼峰，不會(huì)干擾赤蘚紅特征峰的判斷。赤蘚紅的特征峰為400～1 700 cm-1，譜峰強(qiáng)度隨著赤蘚紅濃度的降低而減弱，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低至0.05 mg/kg時(shí)赤蘚紅的特征信號(hào)中已有部分特征峰消失，由此說明赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)限為0.05 mg/kg。

為更好地考察赤鮮紅的SERS信號(hào)與其濃度的跟隨關(guān)系，以赤鮮紅濃度為橫坐標(biāo)，位于1 168 cm-1特征峰的峰高為縱坐標(biāo)，進(jìn)行作圖，結(jié)果見圖2(b)。由圖2(b)可知，該峰強(qiáng)度隨赤蘚紅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高迅速增強(qiáng)，并在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)區(qū)間強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。采用 Langmuir吸附等溫式，Q=kQC/(1+kC)擬合該曲線，其中C代表目標(biāo)物的平衡濃度，Q代表最大的單層吸附量，k代表Langmuir吸附等溫式常數(shù)。由此可知，Langmuir吸附等溫式可較好地?cái)M合該曲線，表明目標(biāo)分子在納米金粒子表面可能以單分子層吸附為主。

圖2 不同濃度赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)品的SERS譜(a)及其工作曲線(b)

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

在此對(duì)吸附劑、淋洗液和洗脫液進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 吸附劑優(yōu)化

分別選用弗羅里硅土、C18和聚酰胺粉作為吸附劑，對(duì)摻雜飲料樣品進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果見圖3。由圖3可知，弗羅里硅土在飲料這種水溶液中吸附色素的能力較弱，未能較大程度地保留赤蘚紅在SPE柱上，且在淋洗過程中有所損失，導(dǎo)致最后回收率太低。C18吸附能力較強(qiáng)，但洗脫時(shí)沒有合適的洗脫液將SPE柱上吸附的赤蘚紅較充分地洗脫，從而導(dǎo)致檢測(cè)限較高，不滿足實(shí)際檢測(cè)需求。聚酰胺粉是較常用的色素吸附劑，配合弗羅里硅土使用，可以有效地吸附赤蘚紅，保證了赤蘚紅較高的回收率。因此，選擇了聚酰胺粉配合弗羅里硅土作為本實(shí)驗(yàn)的吸附劑。

圖3 不同填料對(duì)檢測(cè)西瓜汁中赤蘚紅(10 mg/kg)SERS譜的影響

2.2.2 淋洗液的優(yōu)化

分別考察乙醇水溶液、弱酸性溶液、弱堿性溶液作為第二次淋洗液對(duì)赤蘚紅檢測(cè)的影響，結(jié)果見圖4。當(dāng)采用1 mL水先淋洗1次SPE柱時(shí)，其作用為去除西瓜汁中其他水溶性色素的干擾，且可帶走部分溶于水的碳酸雜質(zhì)。由圖4可知，乙醇水溶液作為第二次淋洗液可獲得很好的淋洗效果，得到的赤蘚紅檢測(cè)信號(hào)最好。

圖4 淋洗液對(duì)西瓜汁中10 mg/kg赤蘚紅的SERS譜的影響

2.2.3 洗脫液的優(yōu)化

由于赤蘚紅結(jié)構(gòu)中帶有羧酸根([COO]-)基團(tuán)，故在洗脫液中加入適量乙酸銨，能促進(jìn)赤蘚紅順利洗脫?？疾觳煌|(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、2%、5%和10%)乙酸銨用以洗脫，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著乙酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高，洗脫效果先提高后降低，2%乙酸銨洗脫后SERS信號(hào)最好。因此選擇2%作為最佳乙酸銨使用量。

圖5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙酸銨洗脫液對(duì)西瓜汁中10 mg/kg赤蘚紅SERS譜的影響

2.3 西瓜汁中赤蘚紅的檢測(cè)分析

圖6是赤蘚紅摻雜的西瓜汁樣品經(jīng)過預(yù)處理后的SERS譜圖。由圖6可知，在400～1 700 cm-1波段，赤蘚紅有很好的特征峰。隨著赤蘚紅摻雜濃度的降低，特征峰拉曼增強(qiáng)信號(hào)也逐步減弱，在赤蘚紅摻雜量低于0.5 mg/kg時(shí)，在400～1 700 cm-1波段的特征峰已經(jīng)變得很弱。由此說明，該方法檢測(cè)西瓜汁樣品中赤蘚紅的檢測(cè)限為0.5 mg/kg。

圖6 西瓜汁中不同模擬質(zhì)量分?jǐn)?shù)赤蘚紅的SERS譜

2.4 不同飲料中赤蘚紅的檢測(cè)分析

圖7是不同飲料樣品在赤蘚紅的摻雜量為0.5 mg/kg并經(jīng)過預(yù)處理后的SERS譜。由圖7可知，4種不同飲料的檢測(cè)效果與西瓜汁相近。另外，也采用上述方法對(duì)10多種可能添加赤蘚紅的飲料樣品進(jìn)行了同樣的測(cè)試，獲得了一致的結(jié)果，見表1。這意味著本研究推薦的方法能夠?qū)崿F(xiàn)盲樣的定向檢測(cè)，即對(duì)于任意飲料樣品，采用上述前處理和SERS檢測(cè)方案，可以實(shí)現(xiàn)赤蘚紅的快速、高靈敏度的檢出。與上述方法相比，現(xiàn)有基于紫外可見分光光度法的快檢產(chǎn)品前處理較為復(fù)雜，而且非人工色素與赤蘚紅吸收峰發(fā)生交疊，分辨率弱于SERS光譜。

圖7 不同飲料中模擬0.5 mg/kg赤蘚紅的SERS譜

表1 SERS譜法測(cè)不同飲料中赤蘚紅(0.5 mg/kg)

3 結(jié)論

針對(duì)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的問題，以及通?？鞕z方法準(zhǔn)確率低、假陽性高等缺點(diǎn)，本文中，筆者提出了一種基于SERS光譜技術(shù)的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查方法。該方法具有快速、便捷、高靈敏度、高準(zhǔn)確度等優(yōu)點(diǎn)。本研究建立的方法可以作為一種現(xiàn)場(chǎng)快速篩查手段，用于飲料中易濫用人工合成色素赤蘚紅檢測(cè)；可同時(shí)滿足監(jiān)管部門采用便攜式拉曼光譜儀進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)法和實(shí)驗(yàn)室預(yù)檢的需求。