核酸檢測：神奇的病毒捕手

陳錚

人人參予 攝影 路保林

自從此次新冠疫情開始，我們經(jīng)常能聽到一個詞語：核酸檢測。

咽拭子輕輕一刮，就能檢出是否感染了新冠病毒。核酸檢測到底是如何做到讓看不見的病毒無處遁形的？這么牛的技術(shù)又是如何被發(fā)明和應(yīng)用到病毒檢測這個領(lǐng)域的？

從基因?qū)用娌閷ぶ虢z馬跡

根據(jù)國家衛(wèi)健委和國家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合下發(fā)的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》，“釆用RT-PCR或/和NGS方法在鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、糞便等標(biāo)本中可檢測出新型冠狀病毒核酸”，是確診新冠病毒感染最重要的病原學(xué)檢查依據(jù)。也就是說，核酸檢測，可以確定咽拭子、痰液等標(biāo)本中到底有沒有新冠病毒。

說起核酸，它其實(shí)是所有生命體必不可少的一種組成物質(zhì)，主要的職責(zé)就是攜帶生命體的遺傳信息。核酸主要分為兩種：脫氧核糖核酸（大家可能更熟悉它DNA這個名字）以及核糖核酸（RNA）。

DNA和RNA都是由一系列“核糖核苷酸”組成的鏈條，DNA是由兩條鏈組成的雙螺旋結(jié)構(gòu)，而RNA則只有一條鏈。鏈條上不同種類核糖核苷酸的排列順序，就是遺傳信息。

在新冠病毒這樣的病毒生物中，攜帶遺傳信息的物質(zhì)是RNA，每種病毒的RNA，都有其獨(dú)特的分子排列特征，就像病毒的指紋。所謂病毒核酸檢測，也就是使用特有技術(shù)，尋找病毒特有的RNA，能找到，我們就可以確定病毒的存在了。

尋找病毒RNA的方法有兩種，就是上面提到的RT-PCR（反轉(zhuǎn)錄基因擴(kuò)增）和NGS（基因組測序）。

RT-PCR出結(jié)果快（約3-6小時(shí)出結(jié)果），NGS測序比較慢（約24-72小時(shí)出結(jié)果），所以大多數(shù)人核酸檢測采用的是RT-PCR這種方法。

用熒光標(biāo)記快速定位病毒的RT-PCR技術(shù)

假設(shè)我們的咽拭子、鼻拭子、痰液等樣本中含有新冠病毒，RT-PCR檢測基本上是這樣一個過程：

第一步，從標(biāo)本中提取新冠病毒的RNA。簡單來說，就是向咽拭子、鼻拭子、痰液等標(biāo)本中加核酸提取試劑，這些提取劑會把病毒的外殼破壞掉，新冠病毒內(nèi)的RNA核酸釋放出來。

圖片 大琦

第二步，是把新冠病毒RNA“反轉(zhuǎn)錄”成DNA。簡單來說，就是使用“反轉(zhuǎn)錄酶”，和核糖核苷酸“原料”，把新冠病毒的單鏈RNA“配對”上另一條由“原料”組成的相呼應(yīng)的單鏈，組成一種特殊的雙鏈DNA——cDNA，暫且管它叫“新冠病毒cDNA”。這么做的原因主要是因?yàn)镽NA只有一條鏈，結(jié)構(gòu)很不穩(wěn)定，稍不留神就會碎掉或者糊成一坨，這就沒法做后面的檢驗(yàn)了，而雙鏈DNA就穩(wěn)定得多。完成轉(zhuǎn)錄后，下面工作都將圍繞這條雙鏈的新冠病毒cDNA展開。

最主要的是第三步，進(jìn)行新冠病毒cDNA的擴(kuò)增與檢測。簡單來說，就是利用PCR技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）大量復(fù)制新冠病毒cDNA的數(shù)量。大家可以把cDNA的雙鏈想象成一條拉鏈，PCR的過程其實(shí)就是先拉開拉鏈，把cDNA分成兩條單鏈，然后利用“原料”核糖核苷酸合成與兩條鏈分別配對的新單鏈，再利用DNA聚合酶作為拉鏈頭，把原本拉開拉鏈產(chǎn)生的舊單鏈和配對好的新單鏈“拉上”，變成雙鏈。這樣原本一條拉鏈，就變成了兩條拉鏈。反復(fù)重復(fù)這個過程，新冠病毒cDNA就會呈幾何級數(shù)狀被復(fù)制擴(kuò)增出來。

尋找病毒特征的NGS技術(shù)

NGS基因組測序，簡單來說，就是對咽拭子、鼻拭子、痰液等標(biāo)本中所含的所有遺傳物質(zhì)進(jìn)行基因測序，搞清這條單鏈上每一個“鏈齒”都是什么。

NGS的技術(shù)原理比較簡單，但工作起來比較耗時(shí)。

與RT-PCR的前三步一樣，做好RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄，然后通過PCR技術(shù)將cDNA大量擴(kuò)增。

完成前三步后，通過DNA剪切酶，把完整的cDNA鏈條打碎成一系列片段，然后使用高通量測序儀，把各個片段中所含的每一個核糖核苷酸的排列順序都檢測出來，得到一個排列順序的“文庫”。

之后，只需要用已知的新冠病毒核糖核苷酸序列特征，到“文庫”中去作比對，一旦發(fā)現(xiàn)一致，就說明樣本里是含有新冠病毒的，也就是檢測陽性。

結(jié)果陰性也非萬事大吉

核酸檢測陰性，也并不意味著就一定沒有受到病毒感染。這種明明已經(jīng)受到感染，核酸檢查卻呈現(xiàn)陰性的現(xiàn)象，被稱為“假陰性”。

任何測量、檢驗(yàn)的方法都難免有誤差。如采集樣本（如咽拭子）時(shí)，沒有取到受到病毒感染的部位，樣本中就可能不含病毒;如果所取到的樣本中病毒太少，也會導(dǎo)致結(jié)果陰性;樣本在儲存、運(yùn)輸中出問題，導(dǎo)致樣本中病毒核酸遭到破壞失去活性，檢測結(jié)果可能會呈現(xiàn)陰性;試劑盒的質(zhì)量穩(wěn)定和一致性等因素也可能導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性的狀況。

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“自由散漫”催生的偉大技術(shù)

PCR的最早期理念，出自遺傳信息之父、美籍印裔科學(xué)家哈爾·葛賓·科拉納（H Gobind Khorana），科拉納20世紀(jì)70年代就多次表示，如果有合適的酶和引物，DNA是可以在體外環(huán)境下被高效合成。當(dāng)時(shí)，能夠穩(wěn)定使用的DNA聚合酶還沒有被發(fā)現(xiàn)，因此，科拉納還無法實(shí)現(xiàn)這一設(shè)想。

真正將PCR技術(shù)開發(fā)落地的，是美國科學(xué)家穆利斯（K Mullis）。

穆利斯是一個非常桀驁不馴且生活放蕩不羈的人，在20世紀(jì)70-80年代，穆利斯似乎受了嬉皮文化的影響，經(jīng)常和人起沖突。作為一個生物化學(xué)領(lǐng)域的學(xué)者，他卻在自制迷幻藥的過程中突發(fā)靈感，寫了一篇解釋宇宙大爆炸的物理學(xué)論文，而這篇“用幽默的大白話寫成的論文”，居然還發(fā)表在頗具學(xué)術(shù)影響力的《自然》周刊上。隨后，穆利斯也頻繁轉(zhuǎn)換自己的研究方向，但是每一個研究方向他都很快感到厭煩。

直到1979年，穆利斯加入了Cetus生物技術(shù)公司開始生物技術(shù)研究，才稍微穩(wěn)定下來。1983年春季的一天，穆利斯在高速公路上瘋狂飆車，突然迸發(fā)出了一個擴(kuò)增DNA的技術(shù)靈感。

在初步實(shí)驗(yàn)中，穆利斯使用了循環(huán)復(fù)制和兩個引物共同參與反應(yīng)的方法，已經(jīng)具備了PCR技術(shù)雛形。

1984年，穆利斯因?yàn)槟信P(guān)系方面的不檢點(diǎn)而得罪了Cetus公司的同事，整個公司從上到下對穆利斯怨聲載道。Cetus公司告訴穆利斯，他只有1年時(shí)間，這期間公司會全力支持穆利斯的研究，如果研究失敗，穆利斯就得收拾鋪蓋走人。

在Cetus公司研究員們的共同努力之下，穆利斯團(tuán)隊(duì)在1984年11月正式完成了全世界第一個PCR實(shí)驗(yàn)，將一個DNA片段進(jìn)行了10次PCR循環(huán)的復(fù)制擴(kuò)增。PCR技術(shù)終于問世！