氯喹通過下調(diào)Wntβ-catenin通路表達抑制低氧環(huán)境下肝癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移

劉得水 周建文 程昊 趙詩瑤 李洋 張英華 徐廣有

摘 ?要：目的 ?本研究探討氯喹對肝癌細胞在低氧環(huán)境下的增殖和侵襲的影響及其潛在的作用機制。方法 ?取肝癌細胞HepG2細胞分成空白對照組，陰性對照組，和氯喹干預組，采用qPCR檢測氯喹在肝癌細胞HepG2以及正常肝組織上皮細胞SMMC-7721中氯喹的表達水平。用氯喹處理HepG2細胞;通過MTS微量酶反應比色法、流式細胞術(shù)、western blot，葡萄糖和乳酸檢測分析試劑盒，檢測給予氯喹刺激后對HepG2的增殖、侵襲的影響、以及其對Wntβ-catenin通路表達的影響。結(jié)果 ?與空白對照組相比，氯喹組的HepG2遷移能力顯著降低（P<0.05），氯喹組總凋亡率為35.5%，對照組總凋亡率為13.4%，氯喹組總凋亡率顯著升高（P<0.05）。氯喹組OD 520值為（8.51±0.45），對照組為（2.97±0.33），氯喹組細胞侵襲能力降低（P<0.05）。Wntβ-catenin通路的相關(guān)蛋白表達降低。結(jié)論 ?氯喹可通過調(diào)控Wntβ-catenin通路表達，調(diào)控HepG2細胞增殖，凋亡及侵襲能力。

關(guān)鍵詞：肝癌;氯喹;增殖;Wntβ-catenin通路

中圖分類號：R735.7 ? ?文獻標識碼：A ? ?文章編號：1009-8011（2020）-11-0039-03

肝癌是我國發(fā)病率非常高的分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，易復發(fā)，5年生存率極低。目前迫切需要找到新的分子靶點和治療策略來遏制肝癌發(fā)展惡化[1-3]。氯喹是一種抗瘧原蟲藥，其作用機制在于本品與核蛋白有較強的結(jié)合力，插入到DNA的雙螺旋兩股之間，可與DNA形成復合物，從而阻止DNA的復制與RNA的轉(zhuǎn)錄[4-5]。目前腫瘤細胞代謝方面的研究已成為當今腫瘤研究的熱點。本研究將通過分子實驗預測氯喹對肝癌細胞增殖與分化以及糖代謝的影響，為臨床診治提供新靶標。

1 ?材料與方法

1.1 ?細胞培養(yǎng)

肝癌HepG2（ATCC○ CRL-1420TM）細胞購自中國科學院細胞庫，正常肝組織上皮細胞SMMC-7721（由廣州燁善生物科技有限公司提供）用10%FBS（Hyclone，USA）、DMEM（Gibco Corporation，USA）培養(yǎng)于37℃、5%C02潮濕大氣細胞培養(yǎng)箱中。將實驗分為三組：空白對照組，陰性對照組，氯喹干預組。

1.2 ?氯喹濃度及給藥方式

從湖北邦盛化工有限公司購入氯喹100g。按照說明書以5mg/mL劑量將氯喹加入HepG2細胞氯喹干預組中。

1.3 ?Western blot法檢測蛋白表達

利用細胞裂解液將蛋白從細胞中提出，12000rpm離心15min，用雙氰胺酸（BCA）法測定蛋白濃度，使用含有聚丙烯酰胺凝膠的SDS電泳分離蛋白質(zhì)樣品，將分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用5%牛血清白蛋白在TBST緩沖液中阻斷2h后，用抗體在4℃孵育過夜。用TBST緩沖液沖洗3次10min，用相應的HRP標記的二級抗體在室溫下孵育2h，再用TBST緩沖液沖洗3次。用化學發(fā)光HRP底物增強化學發(fā)光檢測系統(tǒng)對印跡信號進行可視化。檢測beclin-l，LCI，LC-llc-myc，cyclin D1 klotho，β-tublin，lamin BI表達。

1.4 ?MTS法檢測細胞增殖

將細胞接種到96孔板中，濃度為1×103個細胞/孔，貼壁過夜。每24h，20μL溶液試劑添加到每孔中，使用酶聯(lián)免疫吸附測定儀（BioTek，VT，美國）在37℃孵育3h后，酶標儀讀板，MTS檢測讀取OD490數(shù)據(jù)根據(jù)以下公式計算存活率：存活率=[（實驗組吸光度-空白組吸光度）/（對照組吸光度-空白組吸光度）]×100%。

1.5 ?流式檢測細胞凋亡

將細胞培養(yǎng)板各組的培養(yǎng)基分別轉(zhuǎn)移到15mL的錐形管中并置于冰上。利用胰蛋白酶將細胞消化下來、PBS洗滌后48h收集細胞，用Annexin V凋亡檢測試劑盒FITC（E.BioSoCion，圣地亞哥，CA92121美國）在室溫下用V-FITC和碘化丙啶染色。用流式細胞儀（BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ）進行細胞凋亡分析。

1.6 ?Transwell檢測細胞侵襲能力

用胰蛋白酶/EDTA法檢測HEPG2細胞的遷移和侵襲。將所有細胞（1.5×105）置于transwell chambers（Corning Incorporated，USA）中進行遷移測定，并將1×104細胞置于涂有150mg基質(zhì)凝膠的上腔室中進行侵襲測定。下腔注入含10%FBS的DMEM。在37℃下孵育12～24h后，移走細胞膜上表面的細胞。膜下表面的細胞被水晶紫固定和染色。在光鏡下觀察和計數(shù)染色細胞。

1.7 ?統(tǒng)計學處理

所有實驗均至少重復3次，實驗數(shù)據(jù)用（x±s）表示，采用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。3組蛋白表達水平，細胞存活率，相關(guān)蛋白表達水平的比較用單因素方差分析，以P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?MTS檢測細胞活力

在給予氯喹后，使用MTS法對不同時間點（0h、24h、48h和72h）的肝癌HepG2細胞活力進行檢測。與對照組相比，氯喹組在48h和72h能夠顯著性抑制細胞活力（t=4.454，P<0.05）并且細胞增殖明顯降低（t=7.823，P<0.05）。見圖1。

2.2 ?給予氯喹對HepG2細胞凋亡率的影響

流式細胞儀分析結(jié)果顯示，給予氯喹后HepG2細胞凋亡明顯，氯喹組總凋亡率為35.5%，而對照組總凋亡率為13.4%，氯喹組總凋亡率顯著升高（χ2=22.353，P<0.05）氯喹組早期凋亡，晚期凋亡和總凋亡細胞數(shù)都較對照組顯著增加（P<0.05）。見圖2A-G。

Transwell檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，氯喹組OD 520值為（8.51±0.45），對照組為（2.97±0.33），氯喹組細胞侵襲能力降低（P<0.05）。氯喹組可抑制HepG2細胞的侵襲能力，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖3A-B。

2.4 ?HepG2 細胞中Wntβ-catenin通路中相關(guān)蛋白表達情況

與對照組相比，氯喹組Koho，B-catenin，表達上升，C-myc和Cyclin DI I的蛋白表達明顯下降，說明氯喹組的Wntβ-catenin被明顯抑制。見圖4。

3 ?討論

對于大多數(shù)腫瘤細胞來說，癌基因的突變起到十分關(guān)鍵的促進作用[6]。惡性腫瘤的發(fā)生與蛋白質(zhì)靶點的突變和異常相關(guān)，氯喹可作為放化療增敏劑提高抗癌療效，抑制細胞生長、分化并誘導細胞凋亡，特別是其能夠抑制自噬的功能在腫瘤治療中具有重要作用。因為自噬在腫瘤生長過程中的角色會隨著疾病的病程變化而不斷產(chǎn)生動態(tài)變化，與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，因此氯喹的自噬抑制作用有望為腫瘤治療提供一種新方法。

本研究中，氯喹可以明顯降低低氧環(huán)境下抑制肝癌細胞的增殖和侵襲能力。表明氯喹對肝癌細胞系具有一定的抗腫瘤活性。有研究報道[6]，自然產(chǎn)生的氯喹是一種Taq DNA聚合酶抑制劑，并可以在體外抑制肝癌的進展，這從側(cè)面印證本研究結(jié)果[7]。本研究表明，氯喹組總凋亡率為35.5%，而對照組總凋亡率為13.4%，氯喹組總凋亡率顯著升高，結(jié)合功能實驗證實，氯喹的表達可以明顯抑制肝癌細胞的增殖和侵襲能力，機制通路實驗表明，氯喹很可能是通過調(diào)節(jié)有關(guān)Wntβ-catenin通路的相關(guān)來調(diào)控肝癌細胞的增殖和侵襲能力。此外，有研究表明，氯喹誘導的腫瘤細胞死亡依賴于p53，抑制p53通路可使腫瘤細胞增值率降低百分之46.65%。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，氯喹也能夠誘導Wntβ-catenin表達缺失，導致肝癌細胞的凋亡，初步提示氯喹誘導的肝癌細胞死亡可能與p53的作用無關(guān)，但仍需進一步證明[8]。

綜上所述，本研究通過功能實驗證實，氯喹可以抑制肝癌細胞的增殖。揭示氯喹有可能成為肝癌治療的有效靶點，但更具體的分子機制和靶向肝癌治療效果，有待今后進一步深入的分子通路和動物實驗來證實。

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