肺動脈高壓關(guān)鍵基因的篩選及生物信息學(xué)分析

仲紅艷，唐珊，趙飛飛，王大新

肺動脈高壓是一種嚴(yán)重的致命性疾病，其可能是特發(fā)性的，也可能是先天性心臟病、自身免疫病、感染等疾病的最終結(jié)果[1]，不管病因為何，病理特征都是肺血管重構(gòu)，隨后右心室重構(gòu)，如果無有效治療措施，最終可致右心衰竭和死亡[2]。據(jù)估計，全球目前約1%的人口患有肺動脈高壓，在65歲以上的人群中，這一比例高達(dá)10%[3]，且在女性中更為流行，男女比例約為1：4[4]。隨著規(guī)范的臨床診療，患者5年生存率已提高到50%～60%[5]。但由于肺動脈高壓分子機制尚不清楚，目前的治療方案通常側(cè)重于緩解癥狀，而不是干預(yù)疾病進(jìn)展。最近幾年，隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了大量的基因信息，肺動脈高壓作為常見重大疾病之一，其基因芯片數(shù)據(jù)的發(fā)展已成為研究新趨勢和熱點。因此，本研究利用信使RNA（mRNA）和微小RNA（microRNA）表達(dá)譜數(shù)據(jù)集來識別肺動脈高壓發(fā)生的關(guān)鍵基因和重要通路，并構(gòu)建microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，從基因?qū)用娣治龇蝿用}高壓發(fā)生的潛在分子機制，為探索肺動脈高壓治療提供一些新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從美國國立生物中心的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中獲取2個mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE113439、GSE117261和1個microRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE67597，樣本均來源于人肺組織，各個數(shù)據(jù)集的特征見表1。

表1 各數(shù)據(jù)集特征

1.2 差異基因獲取方法

用R軟件中的“sva”包去除2個mRNA數(shù)據(jù)集批間差后通過“l(fā)imma”包進(jìn)行差異表達(dá)分析，最后以P＜0.05和|log2FC | ＞0.5（“FC”表示差異表達(dá)倍數(shù)）為閾值篩選出mRNA數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因，另外，用GEO2R在線分析工具處理microRNA數(shù)據(jù)集，以P＜0.05和|log2FC | ＞1為閾值篩選出差異表達(dá)的microRNA。

1.3 基因分析軟件

通過DAVID 6.8在線數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology， GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，且GO和KEGG各項以P＜0.05為篩選條件。STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白之間相互作用可視化網(wǎng)絡(luò)圖（PPI），TargetScan在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測差異microRNA靶基因，Cytoscape 3.6.1軟件獲取關(guān)鍵基因、關(guān)鍵模塊和構(gòu)建microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異基因

mRNA數(shù)據(jù)集（GSE113439和GSE117261）共包含73個肺動脈高壓樣本和36個正常肺組織樣本。通過R軟件的“sva”包去除批間差（圖1），用“l(fā)imma”包進(jìn)行差異表達(dá)分析，并以P＜0.05和|log2FC |＞0.5為篩選條件，發(fā)現(xiàn)與正常肺組織相比，肺動脈高壓患者肺組織中有226個基因存在差異表達(dá)，其中141個為上調(diào)基因，85個為下調(diào)基因，對這些差異基因做聚類分析，見火山圖（圖2）。另外，microRNA數(shù)據(jù)集（GSE67597）中包含7個肺動脈高壓樣本和8個正常肺組織樣本。利用GEO2R在線分析工具從microRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)集中獲得29個差異表達(dá)microRNA，其中17個表達(dá)上調(diào)，12個表達(dá)下調(diào)。

圖2 226個差異基因的火山圖

2.2 差異基因功能和信號通路富集分析（表2～5）

226個差異基因GO分析包含生物學(xué)過程、細(xì)胞定位、分子功能三部分。這些基因涉及的生物學(xué)過程主要有炎癥反應(yīng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞增殖、黏附等；基因主要位于細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜等；分子功能主要是肝素結(jié)合、整合素結(jié)合、碳水化合物結(jié)合、轉(zhuǎn)運活性、趨化活性等。KEGG富集結(jié)果顯示這些基因主要參與造血細(xì)胞系、性別、錐蟲病、葡萄球菌感染等方面的信號通路。

表2 226個差異基因生物學(xué)過程的GO分析結(jié)果

表3 226個差異基因細(xì)胞定位的GO分析結(jié)果

表4 226個差異基因分子功能的GO分析結(jié)果

表5 226個差異基因KEGG富集分析結(jié)果

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將226個差異基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.6.1軟件中的cytoHubba插件對 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中的基因用Degree算法進(jìn)行篩選。如圖3所示，圓圈顏色越深，代表其度值（degree）越大，本研究以度值排名前十的基因作為關(guān)鍵基因，分別為HGF（degree=23）、KIT（degree=24）、VCAM1（degree=29）、CXCL12（degree=30）、ITGAM（degree=47）、FPR1（degree=26）、CXCL9（degree=24）、CXCR1（degree=24）、TLR8（degree=35）、CXCR2（degree=23）。應(yīng)用Cytoscape 3.6.1中的MCODE插件發(fā)現(xiàn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖中有一個顯著簇集的模塊（圖4），圖4B模塊中包括12個基因，66個邊。將模塊基因進(jìn)行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)其生物過程涉及細(xì)胞趨化、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生、血管生成，模塊基因主要位于高密度脂蛋白粒子、細(xì)胞外間隙，KEGG通路涉及趨化因子信號通路、受體相互作用、金黃色葡萄球菌感染、補體系統(tǒng)。

圖3 226個差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 預(yù)測差異靶基因和構(gòu)建microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)（圖5、6）

由于microRNA可促進(jìn)其靶mRNA降解或抑制翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，所以用TargetScan數(shù)據(jù)庫分開預(yù)測上調(diào)和下調(diào)的差異microRNA靶基因，并分開與差異基因取交集。結(jié)果顯示，17個表達(dá)上調(diào)的microRNA預(yù)測靶基因11 404個，與前述85個表達(dá)下調(diào)的差異基因取交集后得到37個下調(diào)差異靶基因，如圖5A所示。12個表達(dá)下調(diào)的microRNA預(yù)測靶基因13 679個，與前述141個表達(dá)上調(diào)的差異基因取交集后得到106個上調(diào)差異靶基因，如圖6A所示。將這143個差異靶基因做GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)其主要參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞趨化等生物學(xué)過程，涉及的通路主要是趨化因子信號通路、Rap1信號通路等。利用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建差異microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖，如圖5B、6B所示，網(wǎng)絡(luò)中共有22個microRNA，用degree算法篩選，將度值排名前五的microRNA定為關(guān)鍵microRNA，分別為 hsa-miR-656（degree=52）、hsa-miR-4693-5p（degree=41）、hsa-miR-1253（degree=39）、hsamiR-4704（degree=37）和hsa-miR-302f（degree=34）。DAVID 6.8在線分析這5個關(guān)鍵microRNA對應(yīng)的差異靶基因，發(fā)現(xiàn)其主要參與細(xì)胞增殖、血管生成、炎癥反應(yīng)等過程，涉及的通路主要是腎素-血管緊張素系統(tǒng)、造血細(xì)胞系、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B（PI3K/Akt）、Ras相關(guān)蛋白 1（Rap1） 信號通路等。

圖5 上調(diào)差異microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)

圖6 下調(diào)差異microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)

3 討論

肺動脈高壓是進(jìn)展性難治性疾病，現(xiàn)有治療方法不能完全逆轉(zhuǎn)病理重塑，且尚未完全清楚發(fā)病機制，因此與肺動脈高壓相關(guān)的重要基因和通路有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。本研究分析mRNA和microRNA表達(dá)譜，分別獲得226個差異基因（141個上調(diào)，85個下調(diào)）和29個差異microRNA（17個上調(diào)，12個下調(diào)），這說明肺動脈高壓發(fā)病機制復(fù)雜，是多個基因相互作用的結(jié)果。為進(jìn)一步了解這些基因在肺動脈高壓中的作用，本研究對差異基因、PPI網(wǎng)絡(luò)中顯著簇集的模塊基因、microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)中差異靶基因分別進(jìn)行GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)生物過程主要涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞趨化、炎癥反應(yīng)，這與已有研究報道一致，肺血管平滑肌細(xì)胞異常增殖，導(dǎo)致內(nèi)膜增厚、血管順應(yīng)性喪失，使血管腔變窄，阻礙血液流動，肺動脈壓升高。有研究表明趨化因子水平與肺血流動力學(xué)、右心室功能相關(guān)，趨化因子也參與肺血管重構(gòu)過程，如促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移等[6]。炎癥研究也越來越受青睞，有報道肺動脈周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，炎性細(xì)胞可釋放各種細(xì)胞因子和趨化因子，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺血管重構(gòu)，且肺動脈高壓患者免疫力低下，炎癥容易誘發(fā)肺動脈高壓加重[7]，所以靶向抗炎可能是治療肺動脈高壓新方向[8-10]。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中度值大小識別出HGF、KIT、VCAM1、CXCL12、ITGAM、FPR1、CXCL9、CXCR1、TLR8、CXCR2這10個關(guān)鍵基因。HGF具有刺激肺血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)新生血管形成作用[11]，利用基因轉(zhuǎn)染HGF干預(yù)肺動脈高壓動物模型，發(fā)現(xiàn)HGF能降低肺動脈壓力從而改善肺動脈高壓[12]。KIT編碼的一種Ⅲ型受體酪氨酸激酶，與其受體結(jié)合后磷酸化，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、趨化和細(xì)胞分化[13]，KIT突變有嚴(yán)重的致癌作用，如胃腸道間質(zhì)瘤、黑色素瘤、急性髓細(xì)胞白血病等[14]。VCAM1編碼由促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)的黏附分子，有研究報道系統(tǒng)性硬化癥合并肺動脈高壓（lSSc-PAH）中VCAM1升高[15]，但不能作為lSSc-PAH特異性診斷標(biāo)志物[16]。CXCL9、CXCL12屬于趨化因子中CXC亞家族，研究表明CXCL9與心臟重構(gòu)相關(guān)[17]，血中CXCL12水平升高與特發(fā)性肺動脈高壓患者右心室功能障礙有關(guān)[18]，利用CXCL12中和作用可減輕肺部巨噬細(xì)胞浸潤，從而改善大鼠肺動脈高壓[19]。CXCR屬于趨化因子受體家族，趨化因子受體和配體結(jié)合發(fā)揮重要生物學(xué)功能，例如CXCL8是CXCR1和CXCR2的共同配體，靶向過表達(dá)CXCL8受體（即CXCR1和CXCR2）的肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞，可通過阻斷炎癥細(xì)胞聚集而減輕肺動脈高壓[20]。CXCL12是CXCR4的特異性配體，CXCL12-CXCR4軸參與多種組織的病理過程，缺乏CXCL12或CXCR4的小鼠不能存活，而且有神經(jīng)、血管、心臟方面的發(fā)育缺陷[21]。ITGAM基因編碼CD11b，與系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性有關(guān)，調(diào)節(jié)白細(xì)胞活化、遷移、黏附[22]。FPR1對血管系統(tǒng)的動態(tài)可塑性有重要意義[23]，抑制FPR1能減輕肺部炎癥和缺氧再灌注心肌損傷[24]。TLR8屬于Toll樣受體家族，TLR8激動劑有顯著的抗腫瘤效應(yīng)[25]。綜上，HGF、VCAM1等6個關(guān)鍵基因已報道與肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展相關(guān)，KIT、ITGAM、FPR1、TLR8這4個關(guān)鍵基因目前在肺動脈高壓中尚無具體研究，但也可能是潛在治療靶點，需進(jìn)一步研究。

microRNA是一種小的非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)microRNA失調(diào)與肺動脈高壓的嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)，本研究從microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)中識別出hsamiR-656、hsa-miR-4693-5p、hsa-miR-1253、hsamiR-4704和hsa-miR-302f這5個關(guān)鍵microRNA。一項薈萃分析報道m(xù)iR-656與多種癌癥預(yù)后相關(guān)[26]，研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA NORAD通過吸附miR-656促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展[27]。miR-1253通過靶向WNT5A抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，可能是治療非小細(xì)胞肺癌的治療靶點[28]。另外，KIT、VCAM1和CXCL9這三個關(guān)鍵基因是miR-4693-5p靶基因，CXCL9、CXCL12和VCAM1也分別是miR-1253、miR-4704和miR-302f的靶基因。雖然目前尚無這5個關(guān)鍵microRNA在肺動脈高壓中的具體研究，但其GO分析提示可能參與發(fā)病機制，這為以后的研究提供一些參考。

本研究尚有不足之處，首先，這些在肺動脈高壓組中差異表達(dá)的基因，尤其是關(guān)鍵基因和關(guān)鍵microRNA，需要通過細(xì)胞實驗和臨床樣本進(jìn)一步驗證。其次，這些差異表達(dá)基因和差異 microRNA分別是從不同患者肺組織樣本中篩選，所以結(jié)果會因樣本的不同而影響?？傊?，本研究結(jié)果除了揭示肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展過程中涉及的關(guān)鍵基因和通路及以生物信息學(xué)方法驗證已有研究，也為探索新的治療策略提供了一定的理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突