張貽倫，趙心怡，董淑波，董 超，沈文斌*，董海娟**

（1中國藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院，南京210009；2江蘇德源藥業(yè)股份有限公司，連云港222000）

苯甲酸阿格列汀（alogliptin benzoate，AB），化學(xué)名為（R）-2-｛［6-（3-氨基哌啶-1-基）-3-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氫嘧啶-1（2H）-基］甲基｝芐氰苯甲酸鹽（圖1），是日本武田制藥研發(fā)的一種治療2 型糖尿病的新藥，2010 年4 月在日本省首次獲準(zhǔn)上市，商品名為Nesina，2013 年1 月美國FDA 批準(zhǔn)阿格列汀上市，2013 年7 月我國CFDA 批準(zhǔn)進(jìn)口阿格列汀上市，商品名尼欣那。苯甲酸阿格列汀是一種高度選擇性的絲氨酸蛋白酶二肽基肽酶Ⅳ（DPP-IV）抑制劑，能夠抑制胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素多肽（GIP）的分解，促進(jìn)胰島素的分泌，從而發(fā)揮降糖作用，用于2型糖尿病患者血糖的控制。臨床研究表明，患者對該藥的耐受性良好，不良反應(yīng)輕微［1～5］。目前，苯甲酸阿格列汀在各國藥典中均尚未收錄，對于苯甲酸阿格列汀的雜質(zhì)研究相對較少，且側(cè)重于藥物的各種降解雜質(zhì)的研究［6-10］。

Figure 1 Structure of alogliptin benzoate

本研究從苯甲酸阿格列汀大生產(chǎn)合成過程中分離純化制備得到了苯甲酸阿格列汀的4 種有關(guān)物質(zhì)，根據(jù)其合成工藝和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，經(jīng)過核磁共振、高分辨質(zhì)譜、紅外光譜等多種光譜鑒定方法，確認(rèn)了這4 種化合物的結(jié)構(gòu)（圖2），這4 種有關(guān)物質(zhì)尚無文獻(xiàn)報道，屬于新發(fā)現(xiàn)的雜質(zhì)。本研究中分離出苯甲酸阿格列汀生產(chǎn)工藝中產(chǎn)生的有關(guān)物質(zhì)、確證其結(jié)構(gòu)、積累充分的數(shù)據(jù)，對產(chǎn)品質(zhì)量控制具有重要意義，同時也可為確定合理的關(guān)鍵工藝步驟及參數(shù)范圍提供參考依據(jù)。

Figure 2 Impurities structures of alogliptin benzoate

1 材 料

1.1 藥品與試劑

KBr（光譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；柱色譜硅膠（青島美高集團(tuán)有限公司）；薄層色譜硅膠板（GF254 薄板，浙江臺州市路橋四甲生化塑料廠）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司），其他試劑均為市售分析純，水為純凈水；（R）-3-氨基哌啶二鹽酸鹽（工業(yè)級，成都美域高制藥有限公司）；3-甲基-6-氯尿嘧啶（95%，藥明康德新藥開發(fā)有限公司）。

1.2 儀 器

1260-6230 TOF LC-MS 質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；UV-2550 PC 紫外光譜儀（日本島津公司）；TENSOR 27 型紅外光譜儀、AV-500 型核磁共振儀（德國布魯克公司）；QuikSep-PO300DII制備高效液相色譜儀（北京惠德易科技責(zé)任有限公司）；SP ODS-A 制備柱（50 mm × 250 mm，5 μm，北京惠德易科技責(zé)任有限公司）。

2 方 法

2.1 苯甲酸阿格列汀的合成方法

本研究采用參考文獻(xiàn)［11］的方法，對合成條件及溶劑進(jìn)行優(yōu)化，以3-甲基-6-氯尿嘧啶為原料和2-氰基溴芐反應(yīng)得2-｛［6-氯-3-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氫嘧啶-1（2H）-基］甲基｝苯甲腈（中間體1），再與（R）-3-氨基哌啶二鹽酸鹽經(jīng)親核取代反應(yīng)得（R）-2-｛［6-（3-氨基哌啶-1-基）-3-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氫嘧啶-1（2H）-基］甲基｝苯甲腈（中間體2），最后與苯甲酸成鹽得到苯甲酸阿格列汀，避免了氨基保護(hù)、脫保護(hù)的繁瑣步驟，改進(jìn)后的工藝反應(yīng)步驟少、條件溫和、操作簡單，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2 苯甲酸阿格列汀雜質(zhì)的分離制備

雜質(zhì)L 的制備：產(chǎn)生于生產(chǎn)工藝第1 步中，存在于中間體1 及其母液中，可以傳遞至第2 步反應(yīng)中。雜質(zhì)L 主要是通過對第2 步二氯甲烷廢液進(jìn)行柱色譜分離得到。

收集中間體2制備過程中的二氯甲烷廢液，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，析出固體，直至剩余母液體積約0.5 L，過濾分出濾餅，剩余母液采用濕法上柱，玻璃色譜柱直徑3.3 cm，裝柱高度約40 cm。先用二氯甲烷洗脫，至未吸附組分被完全沖出（此部分不收集），再用二氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脫，收集Rf在0.4～0.9之間的一系列組分的混合液，減壓濃縮，至二氯甲烷基本蒸出，體系為深棕色甲醇和雜質(zhì)的懸濁液，過濾分離母液和濾餅。將收集的母液用濕法上柱，正己烷-乙酸乙酯（5∶1→1∶1）沖柱，收集Rf在0.6～0.8 之間的組分，合并，減壓濃縮至干，然后用干法制沙，上柱，正己烷-乙酸乙酯（15∶1→1∶1）沖柱，收集Rf為0.8 的組分，減壓濃縮至干后即得雜質(zhì)L。

Figure 3 Synthetic route of alogliptin benzoate

雜質(zhì)M 的制備：產(chǎn)生于生產(chǎn)工藝第1 步中，其制備過程基本與雜質(zhì)L相同，在獲得深棕色甲醇和雜質(zhì)的懸濁液后過濾分離母液和濾餅。母液用于制備雜質(zhì)L，而濾餅用于制備雜質(zhì)M。濾餅烘干，取5.0 g，用二氯甲烷100 mL 加熱溶解，加入硅膠25 g，減壓濃縮制沙。玻璃色譜柱直徑約4 cm，使用120 g 硅膠裝柱，上樣后用二氯甲烷-乙酸乙酯（20∶1→10∶1）沖柱，收集Rf為0.8的洗脫液。將洗脫液減壓濃縮至干，加入乙酸乙酯30 mL，回流打漿0.5 h，室溫攪拌2 h，過濾。將濾餅置于50 ℃鼓風(fēng)干燥箱干燥過夜，即得到雜質(zhì)M。

雜質(zhì)T 的制備：產(chǎn)生于生產(chǎn)工藝第2 步中，為中間體2 相關(guān)雜質(zhì)。取第2 步反應(yīng)二氯甲烷廢液，減壓濃縮至干，用殘留物3倍質(zhì)量的硅膠和適量二氯甲烷制沙，裝柱，用乙酸乙酯-二氯甲烷-正己烷（1∶1∶7→1∶1∶2）洗脫，收集含有47.2 min 組分的洗脫液，減壓濃縮。將收集的濃縮物用甲醇溶解，配制成20 mg/mL的溶液，進(jìn)樣量3 mL，用制備液相進(jìn)行分離。柱溫30℃，以乙腈-水（60∶40），流速40 mL/min，檢測波長278 nm，收集主成分（17～19 min），減壓濃縮至干，即得雜質(zhì)T。

雜質(zhì)V 的制備：產(chǎn)生于生產(chǎn)工藝第1 步中，是從中間體1 的甲苯母液中分離獲得。取第1 步反應(yīng)的甲苯母液2 L，用2 mol/L 鹽酸洗滌至洗滌液呈酸性，然后將甲苯層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮至干，加入殘留物質(zhì)量3 倍的硅膠和適量二氯甲烷，加熱攪拌使殘留物溶解并吸附至硅膠上，然后減壓濃縮除去二氯甲烷，得到負(fù)載上樣品的硅膠，然后上柱。用二氯甲烷-乙酸乙酯（30∶1→10∶1）洗脫，收集中間體1 檢測方法下保留時間9.9 min 的洗脫液。將洗脫液減壓濃縮至干，即得雜質(zhì)V。

3 結(jié)果與討論

3.1 雜質(zhì)L的結(jié)構(gòu)鑒定

白色粉末狀固體，由其高分辨質(zhì)譜圖得到準(zhǔn)分子離子峰m/z：330.099 44［M+H］+（計(jì)算值：330.100 38），化合物1 的分子量為奇數(shù)，分子中應(yīng)含奇數(shù)個N 原子，同時由m/z332 的峰強(qiáng)度約為m/z330 峰強(qiáng)度的1/3，可以推斷出雜質(zhì)L 含有一個氯原子，推斷其分子式為C17H16ClN3O2，不飽和度為11。在UV 光譜中，最大吸收峰λmax在293.6 nm，227.2 nm 處，說明結(jié)構(gòu)中含有共軛體系。在IR 光譜中，顯示出了羰基（1 712 cm-1），芳腈基（2 229 cm-1），碳碳雙鍵（1 658，1 635 cm-1），苯環(huán)骨架且為1，2-取代苯（1 602，1 572，1 487 cm-1），以及嘧啶環(huán)呼吸振動（1 009 cm-1）的特征吸收峰。

1H NMR（表1）譜中，給出10 組峰，在低場區(qū)δH8～7 的4 個質(zhì)子δ7.88（1H，d）、7.68（1H，t）、7.50（1H，t）和7.42（1H，d）為一個自旋體系，為鄰-二取代苯上的4個芳質(zhì)子，即2-氰基溴芐中的芳環(huán)質(zhì)子。COSY 譜表明δ6.87（1H，m）、6.16（1H，d）、2.18（2H，m）和1.01（3H，t）它們?yōu)橐粋€自旋體系，為片段CH3CH2CH==CH--上的7 個質(zhì)子；δ5.46（2H，s）和3.24（3H，s）是2組孤立信號，δH5.46（s，2H）是2個質(zhì)子，判斷其為2-甲基-芐氰單元中的仲碳質(zhì)子；δH3.26（s，3H）是3 個質(zhì)子，可判斷其為起始原料3-甲基-6氯尿嘧啶中的孤立甲基單元。

13C NMR（表1）和DEPT 譜提示化合物1 的結(jié)構(gòu)中，含有17 個C，其中包含2 個伯碳、2 個仲碳、6個不飽和叔碳和7個不飽和季碳。δC28.4，13.4為兩個甲基碳，δC48.5，26.5 為2 個亞甲基碳；δC138.2、133.7、133.2、128.2、126.6 和119.4 為6 個不飽和叔C；δC159.8、149.8、141.3、139.7、116.8、109.5 和108.8 為7 個 不 飽 和 季 碳。δC159.8 和149.8 的2 個季C 為羰基碳，HMBC 譜中，H-10（δH3.24）與C-11（δC159.8）和C-9（δC149.8）相關(guān)，H-14（δH6.16）與C-11（δC159.8）相關(guān)，δC159.8 的季碳為C-11；H-14（δH6.16）和H-15（δH6.87）與C-12（δC108.8）相關(guān)，故C-12 上連接--CH==CHCH2CH3基團(tuán)；δC116.8 和109.5 的2 個季碳分別為-CN 及與-CN 相連的季碳，δC109.5的季碳與H-8（δH5.46）遠(yuǎn)程 相 關(guān)，為C-1，則δC116.8 為C-7；δC141.3 和139.7 的兩個季碳分別與H-14（δH6.16）和H-6（δH7.88）遠(yuǎn)程相關(guān)，因此它們分別為C-13 和C-2。該雜質(zhì)比中間體1（圖3）多出1 個丁烯基，可能是合成第一步反應(yīng)所得中間體1 與三正丁胺反應(yīng)得到的產(chǎn)物，確定該雜質(zhì)為（E）-2-｛［5-（1-丁烯-1-基）-3-甲基-6-氯-2，4-二氧代-3，4-二氫嘧啶-1（2H）-基］甲基｝苯甲腈。

Table 1 1H NMR and 13C NMR(500/500 MHz)data of Impurities of alogliptin benzoate

3.2 雜質(zhì)M的結(jié)構(gòu)鑒定

類白色粉末狀固體，由其高分辨質(zhì)譜圖得到準(zhǔn)分子離子峰m/z：391.095 27［M+H］+（計(jì)算值：391.095 63），雜質(zhì)M 的分子量為偶數(shù)，分子中應(yīng)含偶數(shù)個N 原子，同時由m/z393 的峰強(qiáng)度約為m/z391 峰強(qiáng)度的1/3，雜質(zhì)M 中含有一個氯原子，推斷其分子式為C21H15ClN4O2，不飽和度為16。在UV光譜中，最大吸收峰λmax在275.6 nm，225.2 nm處，說明雜質(zhì)M 的結(jié)構(gòu)中含有共軛體系。在IR 光譜中，顯示出羰基（1 707 cm-1），腈基（2 225 cm-1），嘧啶環(huán)伸縮振動（1 647，1 622 cm-1），苯環(huán)骨架碳碳雙鍵（1 622，1 601，1 487 cm-1）和環(huán)呼吸振動（980 cm-1）的特征吸收峰。

由雜質(zhì)M 的1H NMR、13C NMR（表1）可知，δH3.24（3H，s）及δC28.5、δC150.6、δC160.9等表明雜質(zhì)M 中存在3，4-二氫-3-甲基-2，4-二氧代-1（2H）-嘧啶片段；COSY 譜表明δ7.89（1H，d）、7.71（1H，t）、7.52（1H，t）和7.49（1H，d）這4個芳質(zhì)子為一個自旋體系，δ7.80（1H，d）、δ7.61（1H，t）、δ7.42（1H，t）和δ7.39（1H，d）這4 個芳質(zhì)子為一個自旋體系，δH5.47（2H，s）和δH4.02（2H，s）表明雜質(zhì)M中存在兩個鄰氰基芐基片段。雜質(zhì)M 與中間體1相比，少了1 個烯質(zhì)子、多了1 個鄰氰基芐基片段，說明12位烯質(zhì)子被鄰氰基芐基所取代。這個結(jié)果與高分辨質(zhì)譜得到的結(jié)果相吻合，即與中間體1相比，增加了8 個碳原子、5 個氫原子和1 個氮原子。所以確定了雜質(zhì)M 為2-｛［5-（2-氰基芐基）-3-甲基-6-氯-2，4-二氧代-3，4-二氫嘧啶-1（2H）-基］甲基｝苯甲腈。該雜質(zhì)可能是生產(chǎn)工藝第一步中1 分子3-甲基-6 氯尿嘧啶與2 分子2-氰基溴芐反應(yīng)得到的中間產(chǎn)物。

3.3 雜質(zhì)T的結(jié)構(gòu)鑒定

類白色絮狀固體，由其高分辨質(zhì)譜圖得到其［M+Na］+峰m/z：423.142 61［M+Na］+（計(jì) 算 值：423.142 76），雜質(zhì)T 的分子量為偶數(shù)，分子中應(yīng)含偶數(shù)個N原子，推斷其分子式為C23H20N4O3，不飽和度為16。

1H NMR（表1）譜可以看出其比雜質(zhì)M 多出一個自旋體系，δ4.01（2H，q）和1.15（3H，t）為乙氧基（--OCH2CH3）上的5 個質(zhì)子，這正好與其分子式比化合物2 的分子式多出C2H5O 相吻合。在雜質(zhì)T的13C NMR（表1），HMBC 譜中，δC158.6 的季碳與H-22（δH4.01）、H-14（δH3.89）、H-8（δH5.24）均遠(yuǎn)程相關(guān)，即為C-13；δC143.4、111.3 和97.0 的3 個季碳均與H-14（δH3.89）遠(yuǎn)程相關(guān)，但其中只有δC97.0 的C 不與苯環(huán)上的質(zhì)子遠(yuǎn)程相關(guān)，為C-12；由于連接基團(tuán)的改變，雜質(zhì)T 中C-12、C-13 的化學(xué)位移改變較大，因此確定了雜質(zhì)T為2-｛［6-乙氧基-5-（2-氰基芐基）-3-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氫嘧啶-1（2H）-基］甲基｝苯甲腈。雜質(zhì)T是在合成反應(yīng)的第2步由雜質(zhì)M與乙醇反應(yīng)轉(zhuǎn)化而來。

3.4 雜質(zhì)V的結(jié)構(gòu)鑒定

類白色粉末狀固體，由其高分辨質(zhì)譜圖得到準(zhǔn)分子離子峰m/z：353.964 40［M+H］+（計(jì)算值：353.963 94），同時由m/z356的峰強(qiáng)度約為m/z354峰強(qiáng)度的4/3，可以推斷出雜質(zhì)V 中含有1 個氯原子和1 個溴原子，其分子式為C13H9BrClN3O2，不飽和度為10。那么雜質(zhì)V 的分子式比中間體1 多1個Br 原子，少1 個H 原子，與雜質(zhì)L 的分子式相比少了C4H7片段，多1個Br原子。

1H NMR（表1）譜中，其與雜質(zhì)L相比少一個自旋體系，即片段CH3CH2CH==CH--上的7個質(zhì)子，這正好與其分子式比雜質(zhì)L 的分子式少了C4H7相吻合。13C NMR（表1）譜，HSQC、HMBC 相關(guān)譜中，δC157.7 和150.1 的2 個季碳為羰基碳，它們來自于原料3-甲基-6 氯尿嘧啶結(jié)構(gòu)單元；H-8（δH5.46）與C-13（δC144.4）、C-2（δC139.2）和C-1（δC109.5）的3 個 季C 遠(yuǎn) 程 相 關(guān)，C-2（δC139.2）還 與H-6（δH7.89）遠(yuǎn)程相關(guān)；C-7（δC116.9）也與H-6（δH7.89）遠(yuǎn)程相關(guān)，δC98.2 則為C-12，Br 原子與12 位碳相連，Br 原子取代了12 位的烯質(zhì)子。所以確定雜質(zhì)V為2-｛［5-溴-6-氯-3-甲基-2，4-二氧代-3，4-二氫嘧啶-1（2H）-基］甲基｝苯甲腈。該雜質(zhì)由中間體1 的母液中分離制得，可能是中間體1與起始物料2-氰基溴芐降解后產(chǎn)生的Br2反應(yīng)而來。

3.5 討 論

研究利用各種分離分析技術(shù)，從苯甲酸阿格列汀藥物的大生產(chǎn)工藝過程中分離鑒定了4個新的有關(guān)物質(zhì)，其中3 個化合物為中間體1 的相關(guān)雜質(zhì)，1個化合物為中間體2的相關(guān)雜質(zhì)。對于如何在生產(chǎn)工藝中控制這4個雜質(zhì)的產(chǎn)生，有待進(jìn)一步研究。