劉煜瑩，李 瑤，楊 強，陳 冉，李開鈴，張景勍*

（1重慶醫(yī)科大學(xué)重慶藥物高校工程研究中心，重慶400016；2重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心，重慶400036）

天冬酰胺酶（asparaginase，Asp）是臨床用于治療淋巴細(xì)胞白血病的一線化療藥物［1］。Asp 能將細(xì)胞內(nèi)的門冬酰胺分解為門冬氨酸和氨，使腫瘤細(xì)胞因缺少生長所必要的門冬酰胺而引起蛋白質(zhì)合成障礙，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡［2］。大量的臨床研究顯示，Asp 能顯著改善急性淋巴細(xì)胞白血病的預(yù)后，對提高急性淋巴細(xì)胞白血病的完全緩解率及長期無事件生存率等方面有顯著貢獻(xiàn)［3］。但是，Asp 存在蛋白質(zhì)類藥物固有缺陷如活性低、半衰期短和易產(chǎn)生耐藥性［4］，且有研究表明Asp 在體內(nèi)有一定的不良反應(yīng)［5］，直接限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。

為了延長Asp在大鼠體內(nèi)的滯留時間，研究人員采用葡聚糖/聚精氨酸層的CaCO3納米粒裝載Asp［6］，田明達(dá)等［7］用殼聚糖和油酸鈉修飾的超順磁性四氧化三鐵納米粒子裝載Asp，Ashrafi 等［8］用一種新型脂肪酸與Asp 進(jìn)行生物接合，Chien 等［9］對Asp 進(jìn)行PEG 化修飾等，這些針對Asp 劑型的改造在一定程度上阻斷了蛋白酶對Asp 分解以及溫度對Asp 活性的影響，但是仍未解決Asp 免疫原性高、生物相容性低和體內(nèi)循環(huán)時間短等不足。因此構(gòu)建一個既能提高Asp體內(nèi)穩(wěn)定性，同時又能提高其生物相容性及生物利用度的遞送系統(tǒng)十分必要。透明質(zhì)酸具有靶向性，可以和腫瘤細(xì)胞中的CD44 受體結(jié)合［10］。自組裝納米系統(tǒng)載藥量大，制備簡單［11］。

為了提高Asp體內(nèi)活性和生物利用度，本研究首次制備了透明質(zhì)酸（HA）修飾Asp 自組裝仿生納米囊（hyaluronic acid-modified asparaginase self-assembled bionic nanocapsules，ASNCs）。首 先 將PEG2000 與HA 分子偶聯(lián)形成兩親性的HA-g-PEG，該兩親性HA-g-PEG 與羥丙基-β-環(huán)糊精能自組裝形成仿生膜，同時將Asp 固定在仿生膜中，然后再一起包封于脂質(zhì)納米囊中。本實驗對ASNCs的體外抗胰蛋白酶水解穩(wěn)定性和體內(nèi)藥代動力學(xué)行為進(jìn)行了考察，以期為大分子藥物的臨床研究提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 試 劑

天冬酰胺酶（Asp，純度：96%，批號：312PLASP 1，以色列Prospec 公司）；天冬酰胺、膽固醇（美國Sigma 公司）；磷脂（純度：100%，德國Lipoid 公司）；羥丙基-β-環(huán)糊精（HPCD，純度：98%，南京都萊生物技術(shù)有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、考馬斯亮藍(lán)G-250（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；HAg-PEG（實驗室自制［12］）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

85-2 型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；pH 計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；UV-7504 PC 紫外分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）。

1.3 動 物

雄性SPF 級SD 大鼠，體重（200±20）g。由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SYXK（渝）2016-0001，所有動物實驗均符合動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 ASNCs的制備及形態(tài)考察

按照處方量精確稱取膽固醇和磷脂（物質(zhì)的量比為1∶3）放置于圓底燒瓶中，加入二氯甲烷15 mL 使之溶解，于黑暗處放置30 min。將圓底燒瓶放置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，30 ℃減壓旋蒸至形成均勻的薄膜，加入乙醚15 mL 搖晃脫膜。將HA-g-PEG 溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%）2 mL 緩慢加入至HPCD 飽和溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%）6 mL 中形成的HA-g-PEG/HPCD 溶液，精密稱取處方量Asp 1 mg溶解于HA-g-PEG/HPCD 溶液中，然后加入到上述圓底燒瓶中，使用水浴型超聲儀超聲，直至形成均勻帶乳光的分散體系。將圓底燒瓶轉(zhuǎn)移至旋蒸儀，30 ℃減壓蒸發(fā)，至形成凝膠狀塌陷為均勻液體，取出液體加入至10 mL 量瓶用pH 7.3 的Tris-HCl 緩沖液定容，即得ASNCs。用pH 7.3 的Tris-HCl 緩沖液將ASNCs 稀釋10 倍后，于透射電鏡下觀察ASNCs 的外觀形態(tài)，馬爾文激光粒度儀測定ASNCs的粒徑和電位。

2.2 活性測定

Asp 的活性采用奈斯試劑法［13］進(jìn)行測定。實驗前，將底物天冬酰胺溶液預(yù)熱2 min，在底物天冬酰胺溶液中加入Asp 溶液0.1 mL，置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，即刻加入三氯醋酸溶液0.1 mL以終止反應(yīng)，離心后取出上清液，取奈斯勒指示劑和適量蒸餾水加至上清液中，放置10 min 后，于480 nm處測定吸收度。

2.3 抗胰蛋白酶水解穩(wěn)定性

將Asp 和ASNCs 溶液分別與等量胰蛋白酶溶液混合，在37 ℃條件下孵育，于一系列時間點0，10，20，30，40，50，60 min時分別取出，按照“2.2”項下方法測定游離Asp和ASNCs中Asp的活性。

2.4 藥代動力學(xué)考察

取12只雄性SD大鼠，隨機分成2組，禁食24 h后，尾靜脈分別注射游離Asp 和ASNCs（給藥劑量以Asp 計為2 U/g）。在給藥后0.08，0.17，0.25，0.50，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，10，12，24，48 h眼靜脈取血。采血（約0.3 mL）注入肝素化的試管，4 000 r/min 離心10 min 后分離血漿樣品，于-20 ℃保存待測定。DAS軟件分析處理數(shù)據(jù)，比較Asp和ASNCs 之間藥代動力學(xué)行為和生物利用度的差異。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法

游離Asp 和ASNCs 穩(wěn)定性數(shù)據(jù)通過SPSS 軟件進(jìn)行雙向單側(cè)t檢驗，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 ASNCs的微觀形態(tài)

如圖1所示，透射電鏡下觀察到的ASNCs呈均勻分布的圓形或橢圓形。

3.2 粒徑和Zeta電位

經(jīng)測定，ASNCs 粒徑為（99.17±0.21）nm，Zeta 電位為-（13.13± 0.60）mV，表明ASNCs 的粒徑適中且性質(zhì)穩(wěn)定（n=3）。

3.3 抗胰蛋白酶水解穩(wěn)定性

如圖2 所示，Asp 和ASNCs 在與胰蛋白酶接觸后，活性均受到較大影響，但與ASNCs 相比，游離Asp 受胰蛋白酶水解影響更大。在胰蛋白酶存在的外環(huán)境中，游離Asp 活性下降迅速，降至僅存50%活性所需時間約為15 min，而ASNCs 活性降至50%所需時間大約為35 min，40 min時已無法檢測到Asp 活性，但此時ASNCs 仍保持著34%的活性。這表明，ASNCs 較游離Asp 有更好地抗胰蛋白酶水解的能力，更高的穩(wěn)定性。

Figure 1 Transmission electron microscopy image of hyaluronic acidmodified asparaginase self-assembled bionic nanocapsules（ASNCs）

Figure 2 Proteolytic stabilities of remaining activity of free asparaginase(Asp)and ASNCs(-x ± s,n = 3)

3.4 ASNCs藥代動力學(xué)行為

靜脈注射游離Asp 和ASNCs 后，大鼠體內(nèi)藥物活性-時間曲線關(guān)系圖見圖3。在靜脈注射后，游離Asp和ASNCs活性整體呈下降趨勢，且ASNCs活性始終高于游離Asp。在12 h 時，游離Asp 活性幾乎為零，而此時ASNCs 活性為（1.46±0.375）U/mL，ASNCs 持續(xù)到48 h 才完全失活。這些結(jié)果證實了ASNCs能延長Asp在體內(nèi)的循環(huán)時間。

經(jīng)過DAS 軟件計算得到，游離Asp 和ASNCs主要的藥代動力學(xué)參數(shù)見表1（非房室模型）和表2（房室模型）。分析非房室模型主要藥代動力學(xué)參數(shù) 可 看 出，ASNCs 與 游 離Asp 相 比，AUC0-48h和AUC0-∞分別增加了44.72.32 和47.82 U·h/mL，表明靜注后吸收增加；MRT0-48h和MRT0-∞分別增加了2.32 和2.71 h，同時ASNCs 的CL 降低為游離Asp的40%，表明ASNCs 體內(nèi)的滯留時間增加。并且ASNCs 的cmax為Asp 的1.3 倍，說明ASNCs 的活性更強。各項參數(shù)均表明ASNCs 在體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為優(yōu)于Asp。

Figure 3 Activity-time curves of free Asp and ASNCs(-x ± s,n = 6)

Table 1 Non-compartment model pharmacokinetic parameters of Asp and ASNCs( ± s,n=3)

Table 1 Non-compartment model pharmacokinetic parameters of Asp and ASNCs( ± s,n=3)

Parameter AUC0-48 h/(U·h/mL)AUC0-∞/(U·h/mL)MRT0-48 h/h MRT0-∞/h tmax/h cmax/(kU/L)CL/(L·h-1·kg-1)V/(L/kg)Relative bioavailability/%Asp 46.993±6.634 47.91±7.207 3.311±0.437 3.521±0.532 0.248±0.035 14.444±1.824 0.17±0.023 0.461±0.057-ASNCs 91.71±12.332 95.729±8.426 5.629±1.58 6.23±0.834 0.148±0.045 18.345±2.901 0.084±0.007 0.402±0.084 195.15

室模型參數(shù)見表2，分析其主要藥代動力學(xué)參數(shù) 可 看 出，游 離Asp 和ASNCs 相 比，AUC0-48h和AUC0-∞分別增加了53.62.87 和U·h/mL，表明靜注后吸收增加；t1/2增加了2.31 h，ASNCs的CL降低為游離Asp 的49%，表明藥物在體內(nèi)停留時間增加。各項參數(shù)均表明ASNCs 在體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為優(yōu)于Asp。

分析非房室模型和房室模型主要藥代動力學(xué)參數(shù)可看出，游離Asp 和ASNCs 相比，AUC0-48h和AUC0-∞均有明顯增加，CL 均大幅降低，從AUC0-48h的比較看出，與Asp 相比，ASNCs 的相對生物利用度約為195.15%（非房室模型）或213.54%（房室模型）。非房室模型和房室模型得出的結(jié)果一致。用兩種模型分析得到的結(jié)果可知，ASNCs 提高了Asp 的體內(nèi)活性，降低了清除率，延長了滯留時間，從而提高了Asp的生物利用度。

Table 2 Compartment model pharmacokinetic parameters of Asp and ASNCs( ± s,n=6)

Table 2 Compartment model pharmacokinetic parameters of Asp and ASNCs( ± s,n=6)

Parameter AUC0-48 h/(U·h/mL)AUC0-∞/(U·h/mL)V/(L/kg)CL/(L·h-1·kg-1)t1/2,β/h α β Relative bioavailability/%Asp 47.228±8.724 52.839±15.097 0.308±0.208 0.159±0.036 2.945±0.956 9.988±3.881 0.252±0.068-ASNCs 100.85±16.754 104.021±14.993 0.6±0.118 0.077±0.015 5.262±0.931 2.419±2.217 0.139±0.027 213.54

4 討 論

自組裝納米系統(tǒng)載藥量大，制備簡單［11］，是大分子藥物的理想載體。本研究首先將抗腫瘤酶Asp 包封于自組裝仿生脂質(zhì)納米囊中，并考察了ASNCs 的微觀形態(tài)、體外抗胰蛋白酶水解穩(wěn)定性和體內(nèi)藥代動力學(xué)。從抗胰蛋白酶水解穩(wěn)定性結(jié)果上看，ASNCs 具有比Asp 更高的活性，分析可能原因與包封于脂質(zhì)納米粒中的尿酸酶穩(wěn)定性提高原因類似：蛋白質(zhì)類藥物穩(wěn)定性改變與空間結(jié)構(gòu)如螺旋結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)變化有關(guān)［14］，自組裝仿生脂質(zhì)納米囊能保護Asp的空間結(jié)構(gòu)，使其構(gòu)象不會因為外界條件變化而改變［15］。大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)行為顯示，ASNCs相對生物利用度為游離Asp的2 倍左右，ASNCs 在大鼠體內(nèi)的AUC0-48h和cmax均較Asp 高，說明將Asp 制備成ASNCs 后確實可以提高酶在大鼠體內(nèi)的相對生物利用度，緩釋效果明顯。同時，與黃永佳等［2］制備的Asp 核殼型納米粒相比（AUC0-48h為86.06 U·h/mL），ASNCs 的AUC0-48h提高了5.65 U·h/mL，說明ASNCs 具有更高的生物利用度。分析該納米粒能提高Asp 生物利用度的可能原因一是經(jīng)過透明質(zhì)酸修飾后的納米囊生物相容性更高，避免了Asp在體內(nèi)由于免疫原性高失活的問題；二是納米囊能有效封裝Asp，在進(jìn)入血液后，外界血液中的代謝酶對Asp 的影響減小，從而達(dá)到長效和高效的目的；再者納米囊能維持Asp的構(gòu)象，提高其穩(wěn)定性和活性。

綜上，本研究制備的透明質(zhì)酸修飾的自組裝仿生納米囊，提高了Asp 的穩(wěn)定性和生物利用度，緩釋效果明顯，同時透明質(zhì)酸具有靶向腫瘤細(xì)胞表面受體CD44 的優(yōu)點，磷脂和膽固醇作為內(nèi)源性物質(zhì)具有良好的生物相容性。因此，本實驗為構(gòu)建生物相容性、靶向腫瘤細(xì)胞的Asp遞送系統(tǒng)提供了思路與方法，為Asp遞送系統(tǒng)的進(jìn)一步研究與應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。