陳憶鈴，馮江江，楊海雪，時(shí)雅萍，李龍囡，馮 芳*

（1中國藥科大學(xué)藥物分析系，南京211198；2無錫市藥品檢驗(yàn)所，無錫214028；3揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)南京海陵藥業(yè)有限公司，南京210049）

甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯是DNA 反應(yīng)活性物質(zhì)，在極低水平下仍存在致突變/致癌風(fēng)險(xiǎn)［1-4］，為此，全球藥品監(jiān)督管理部門高度重視，紛紛要求相關(guān)企業(yè)在藥物研發(fā)、生產(chǎn)過程中對其嚴(yán)格控制［5-7］，國家藥典委員會在即將執(zhí)行的2020 版《中華人民共和國藥典》中新增了“遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則”［8］。

甲磺酸鹽類藥物中甲磺酸烷基酯雜質(zhì)可能來源于副反應(yīng)和起始物料甲磺酸。Teasdale 等［9-10］通過實(shí)驗(yàn)研究，提出了在甲磺酸鹽合成過程中最大限度的減少或消除甲磺酸烷基酯的策略。除酸堿化學(xué)計(jì)量比、酸度、溫度、水分含量及反應(yīng)時(shí)間等影響外，起始物料甲磺酸的質(zhì)量十分關(guān)鍵。由于甲磺酸成鹽反應(yīng)主要發(fā)生在藥物合成的最終階段［11-12］，成鹽過程中甲磺酸含有的甲磺酸烷基酯雜質(zhì)很可能被帶入藥物終產(chǎn)物中，帶來安全隱患。因此，對甲磺酸中可能存在的甲磺酸烷基酯進(jìn)行分析監(jiān)測，對于甲磺酸鹽類藥物的安全和質(zhì)量控制十分重要。

有關(guān)甲磺酸中甲磺酸烷基酯類雜質(zhì)檢測的報(bào)道不多。Ramjit等［13］以乙腈為溶劑，采用直接進(jìn)樣GC-MS 法測定了甲磺酸中甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸正丙酯及甲磺酸正丁酯，雖然方法簡單，便于操作，但樣本基質(zhì)容易在氣相進(jìn)樣口造成污染。Zhou 等［14］嘗試采用柱前衍生化-高效液相色譜法測定甲磺酸中甲磺酸烷基酯。由于所用衍生化試劑的親核性較差，該法僅能測定供試品中的甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯，且每個樣品分析需時(shí)30 min。歐洲藥典采用二氯甲烷液液萃取后GC-MS 法分析測定甲磺酸中的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯［15］，方法表觀簡單，但實(shí)際應(yīng)用時(shí)出現(xiàn)回收率偏低的問題。本研究在歐洲藥典方法的基礎(chǔ)上，通過改變對照品溶液的配制方法提高方法的定量準(zhǔn)確度，并考察了質(zhì)譜定量離子及檢測方式、毛細(xì)管色譜柱及升溫程序、進(jìn)樣方式及進(jìn)樣參數(shù)等對方法專屬性和靈敏度的影響，進(jìn)一步通過比較單點(diǎn)校正法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的準(zhǔn)確度，確立了內(nèi)標(biāo)定量方法，并將該方法應(yīng)用于不同來源的甲磺酸質(zhì)量控制與監(jiān)測。

1 材 料

1.1 儀 器

GC-MS-QP2020氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀，配有AOC-20i 自動進(jìn)樣器，GC-MS solution 4.45 版工作站（日本Shimadzu 公司）；BSA124S 型電子天平、BT25S型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試 劑

甲磺酸甲酯（99%，批號：A0356876）、甲磺酸乙酯（99%，批號：A0341901）、甲磺酸異丙酯（99%，批號：A0375206），均購自美國Acros Organics 公司；甲磺酸正丁酯（98%，批號：AK114028，美國Ark Pharm 公司）；二氯甲烷（色譜/光譜級，批號：19045160，美國Tedia 公司）；甲磺酸（≥98%，批號：10210923，美國Alfa Aesar 公司）；甲磺酸（99.5%，批號：F1801073、D1919052，阿拉丁試劑有限公司）；其余均為市售分析純試劑。

2 方 法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 Agilent HP-1MS 毛細(xì)管柱（固定液為100%二甲基聚硅氧烷，30 m × 0.32 mm，1 μm）；進(jìn)樣口溫度220 ℃；柱溫：初始溫度為55 ℃，維持1 min，10 ℃/min 升溫至95 ℃，維持2 min；再以10 ℃/min 升溫至135 ℃，維持2 min；載氣：高純氦氣；流速為2 mL/min；不分流高壓進(jìn)樣：壓力250 kPa，時(shí)間0.5 min；進(jìn)樣量：2μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊源（EI），離子源溫度：230 ℃；接口溫度280 ℃；四極桿質(zhì)量分析器，選擇離子監(jiān)測（SIM）模式。檢測離子、檢測時(shí)間窗信息見表1。

Table 1 SIM mode of components to be tested

2.2 溶液制備

2.2.1 空白溶液 于分液漏斗中精密加入水5 mL及二氯甲烷5 mL，振搖提取，靜置使分層；取下層有機(jī)相加無水硫酸鈉0.7 g，振搖，靜置5 min，取上清液，即得。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 量取甲磺酸正丁酯7 μL，置10 mL 量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)貯備液；精密量取內(nèi)標(biāo)貯備液5μL，置100 mL量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 混合對照品溶液 精密稱取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯各25 mg，置25 mL量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液；精密量取混合對照品貯備溶液74 μL，置10 mL 量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品中間貯備液；精密量取上述溶液100μL，置10 mL量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，備用；于分液漏斗中精密加入5 mL水及上述溶液5 mL，振搖提取，靜置使分層；取下層有機(jī)相加無水硫酸鈉0.7 g，振搖，靜置5 min，取上清液，即得。

2.2.4 供試品溶液 取供試品0.37 g，精密稱定，置分液漏斗中，精密加入水5 mL，搖勻，冷卻至室溫；精密加入內(nèi)標(biāo)溶液5 mL，振搖提取，靜置使分層；取下層有機(jī)相加無水硫酸鈉0.7 g，振搖，靜置5 min，取上清液，即得。

3 結(jié) 果

3.1 專屬性考察

取空白溶液、混合對照品溶液、供試品溶液（≥98%，批號：10210923，美國Alfa Aesar 公司），按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果表明，甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯和甲磺酸正丁酯的保留時(shí)間分別為4.63、5.99、6.89、10.46 min，空白溶液（圖1-A）不干擾測定，各相鄰峰之間分離度良好（圖1-B、1-C），方法專屬性良好。

Figure 1 Characteristic GC-MS chromatograms of blank solution(A),standard solution(B)and test solution(C)

3.2 線性關(guān)系考察

取混合對照品中間貯備液適量加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度制得質(zhì)量濃度約為37，74，370，740，1 480 ng/mL 對照品溶液，經(jīng)萃取-干燥處理后制得系列標(biāo)準(zhǔn)線性溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，以各待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，各甲磺酸酯在37～1 480 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見表2。

Table 2 Result of linearity test of three alkyl methanesulfonates

3.3 定量限和檢測限

MMS、EMS、IMS的定量限分別為36.75、35.49和36.14 ng/mL，定量限精密度分別為1.25%、0.68%和0.37%，定量限準(zhǔn)確度分別為105.73%、105.32%、101.53%。以信噪比約為3∶1 的相應(yīng)濃度作為檢測限，MMS、EMS、IMS 的檢測限分別為7.35、7.10和7.23 ng/mL。

3.4 進(jìn)樣精密度

取混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 次，MMS、EMS、IMS 與內(nèi)標(biāo)峰面積比的RSD 分別為0.51%、0.43%和0.27%，儀器進(jìn)樣精密度良好。

3.5 回收率

取甲磺酸樣本（批號：10210923）共9 份，每份0.37 g，精密稱定，加水5 mL 稀釋，再分別加入質(zhì)量濃度為37、370 和1 110 ng/mL 對照品溶液5 mL，經(jīng)提取干燥制得低、中、高3 種質(zhì)量濃度的加樣回收率溶液，每個質(zhì)量濃度水平各3 份，分別進(jìn)樣分析。另取混合對照品溶液，同法測定?；厥章试囼?yàn)結(jié)果見表3，該方法準(zhǔn)確度良好。

Table 3 Recovery of three alkyl methanesulfonates

3.6 重復(fù)性

按“3.5”項(xiàng)下方法制備加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為37、370 和1 110 ng/mL 的供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算得各濃度水平下各甲磺酸酯峰面積的RSD 均不超過2.78%，該方法重復(fù)性良好。

3.7 穩(wěn)定性考察

取混合對照品中間貯備液適量加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度制得質(zhì)量濃度約為74、370、740 ng/mL 對照品溶液，經(jīng)萃取-干燥處理后，于室溫（25 ℃）下放置0 h 和8 h 后連續(xù)進(jìn)樣分析（n=3），結(jié)果表明，各濃度水平下各甲磺酸酯與內(nèi)標(biāo)峰面積比3 針平均值的相對偏差的絕對值均不超過1.63%，表明對照品溶液室溫下放置8 h穩(wěn)定。

3.8 耐用性考察

試驗(yàn)中分別考察了進(jìn)樣口溫度變化± 20 ℃、進(jìn)樣口壓力變化± 50 kPa、進(jìn)樣時(shí)間變化（0.3、0.5、0.7 min）、以及萃取靜置時(shí)間（0～30 min）對同一甲磺酸樣本含量測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，各項(xiàng)因素下各待測物峰面積的RSD 均不超過3.22%，方法具有較好的耐用性。

3.9 樣本測定

取各甲磺酸樣本按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每個樣本平行制備兩份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備混合對照品溶液，上述溶液均按“2.1”項(xiàng)下條件GC-MS分析，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算供試品中MMS、EMS、IMS的含量，結(jié)果列于表4 Lab 1對應(yīng)欄目；復(fù)核單位驗(yàn)證測定結(jié)果列于表4 Lab 2對應(yīng)欄目。兩個實(shí)驗(yàn)室對相同甲磺酸供試品中甲磺酸烷基酯的測定結(jié)果的相對偏差不超過4.42%，表明所建方法穩(wěn)定性好、通用性強(qiáng)。

Table 4 Result of content of three alkyl methanesulfonates in methanesulfonic acid samples

4 討 論

4.1 溶劑和萃取劑選擇

采用液液萃取預(yù)分離供試品中待測物與主成分，對于毛細(xì)管氣相色譜法定量測定微量雜質(zhì)十分重要。甲磺酸易溶于水或醇等溶劑，甲磺酸烷基酯則在弱極性有機(jī)溶劑中溶解更好。有文獻(xiàn)報(bào)道［16］以正己烷為溶劑測定甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯，待測物峰形嚴(yán)重拖尾；Wollein等［17］用正己烷提取甲磺酸溴隱亭中甲磺酸烷基酯時(shí)回收率偏低，推測是因正己烷為非極性溶劑，不能有效提取水溶液中甲磺酸烷基酯。二氯甲烷微溶于水，與酯類互溶，沸點(diǎn)適宜，在本試驗(yàn)中被用作甲磺酸烷基酯雜質(zhì)的萃取劑，水用作甲磺酸供試品的溶劑。

4.2 質(zhì)譜定量離子及定量方式確定

本試驗(yàn)采用質(zhì)譜選擇性離子監(jiān)測模式定量測定各待測物。其中，甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、內(nèi)標(biāo)甲磺酸正丁酯分別采用豐度最高的m/z80、m/z79、m/z56離子作為定量離子；而甲磺酸異丙酯，因豐度最高m/z43 離子在檢測過程中極易受系統(tǒng)及溶劑等因素干擾［18］，影響測定的專屬性，定量離子采用豐度略低、但質(zhì)荷較大的m/z123 離子。為進(jìn)一步提高檢測靈敏度，試驗(yàn)時(shí)采用了分時(shí)段檢測單個離子序列。

4.3 進(jìn)樣方式的優(yōu)化

甲磺酸中甲磺酸烷基酯的檢測屬于痕量分析范疇。為提高檢測的靈敏度，本試驗(yàn)考察了不分流進(jìn)樣與脈沖不分流進(jìn)樣兩種方式的影響，結(jié)果見圖2。可見，不分流進(jìn)樣測得的色譜圖（圖2-A）中，各待測物響應(yīng)偏小且峰的對稱性差；采用脈沖不分流進(jìn)樣，當(dāng)壓力在200～300 kPa 范圍內(nèi)時(shí)，色譜峰位恒定，各色譜峰峰形對稱，甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯對應(yīng)峰的峰面積分別增加了約134%、77%、140%（圖2-B）。這是由于進(jìn)樣口壓力增加，各待測物在短時(shí)間內(nèi)快速集中進(jìn)入色譜柱，譜帶展寬小，峰形尖銳且對稱度提高。此外，進(jìn)樣口停留時(shí)間減少，也降低了待測物質(zhì)發(fā)生熱降解的可能。

4.4 色譜柱的比較及采用

采用質(zhì)譜選擇性離子監(jiān)測時(shí)，色譜分離對于甲磺酸中甲磺酸烷基酯的準(zhǔn)確測定十分關(guān)鍵。試驗(yàn)初期，參考?xì)W洲藥典，采用100%甲基聚硅氧烷為固定液的非極性毛細(xì)管柱DB-1（15 m×0.25 mm，1 μm），進(jìn)行分離分析。通過調(diào)整起始柱溫、升溫速率、流速等色譜條件，發(fā)現(xiàn)甲磺酸中待測物與相鄰雜質(zhì)的色譜峰之間很難實(shí)現(xiàn)基線分離（圖3-A）；改用5%苯基-95%甲基聚硅氧烷為固定液的毛細(xì)管柱Rxi-5ms（30 m × 0.25 mm，0.25 μm），并嘗試優(yōu)化色譜條件，結(jié)果（圖3-B）雜質(zhì)對甲磺酸乙酯色譜峰仍存在影響；當(dāng)采用HP-1MS（30 m × 0.32 mm，1 μm），并優(yōu)化色譜條件后，甲磺酸供試品色譜圖（圖3-C）顯示，各待測物峰形尖銳對稱，各成分間分離度良好。故最終采用HP-1MS（30 m×0.32 mm，1μm）柱。

Figure 2 GC-MS chromatograms of plitless injection(A) and pulsed splitless injection under 250 kPa(B)

Figure 3 GC-MS chromatograms of test solution(Innochem,Batch No. KSCC904)in DB-1(A),Rxi-5ms(B)and HP-1MS(C)

4.5 對照品溶液配制方式的改變

歐洲藥典以對照品的二氯甲烷溶液作為參照，計(jì)算供試品中甲磺酸烷基酯的含量。據(jù)此試驗(yàn)，結(jié)果均顯示：甲磺酸甲酯存在回收率偏低現(xiàn)象（約75%）?？紤]到供試品溶液測定前經(jīng)歷了二氯甲烷萃取-無水硫酸鈉干燥過程，而對照溶液并無此操作的情況，本研究考察了對照品溶液制備時(shí)經(jīng)萃取-干燥處理與不進(jìn)行處理對測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表5。

顯然，改變對照品溶液配制方式，采用與供試品溶液一樣的萃取-干燥處理，可解決應(yīng)用歐洲藥典方法測定甲磺酸烷基酯時(shí)結(jié)果偏低的問題。

Table 5 Comparison of average recovery before and after extractiondrying process of three alkyl methanesulfonates(n=9)

4.6 定量下限的確定

現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》要求分析方法的定量限須滿足信噪比不小于10∶1，且準(zhǔn)確度、精密度符合要求。為此，本研究考察了甲磺酸烷基酯信噪比約10∶1 時(shí)對應(yīng)的甲磺酸烷基酯質(zhì)量濃度，約為14.8 ng/mL。進(jìn)一步平行制備含此濃度的供試品標(biāo)準(zhǔn)添加溶液，考察方法對甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯測定的準(zhǔn)確度及精密度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精密度均符合要求［8］，但甲磺酸異丙酯測得濃度與標(biāo)準(zhǔn)添加濃度存在的相對偏差達(dá)39.11%，說明方法對14.8 ng/mL 質(zhì)量濃度的檢測達(dá)不到定量要求。提高驗(yàn)證用甲磺酸烷基酯濃度，確定方法的定量限對應(yīng)質(zhì)量濃度為37 ng/mL，此時(shí)各待測物測定的相對偏差均小于20%。

4.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單點(diǎn)校正法的選擇

藥物中雜質(zhì)的定量可采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法或內(nèi)標(biāo)單點(diǎn)校正法，本研究對兩種方法所得結(jié)果的準(zhǔn)確度進(jìn)行了比較。

表6 分別列出了標(biāo)準(zhǔn)曲線法及單點(diǎn)校正法測得的甲磺酸烷基酯低、中、高濃度、理論濃度以及相對偏差。

Table 6 Comparison of standard curve method and single-point calibration method in predicted concentration of three alkyl methanesulfonates

可見，在定量限濃度附近，兩種方法的測得值與理論值的相對偏差均小于18%，中、高濃度水平時(shí)相對偏差均小于8%，符合現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》對分析方法準(zhǔn)確度的要求。鑒于測定的便捷性，內(nèi)標(biāo)單點(diǎn)校正定量最終被用于本研究建立的分析方法。

5 結(jié) 論

本研究建立的液-液萃取結(jié)合GC-MS 法具有簡便、靈敏、專屬、穩(wěn)定且通用性好的特點(diǎn)，已成功用于甲磺酸中微量甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯的含量測定。