鄧小穎，楊旭萍，劉佩芳，張尊建*，黃 寅**

（1中國(guó)藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009；2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，哈爾濱150086）

黃芪為豆科植物膜莢黃芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.］或蒙古黃芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var.mongholicus（Bge.）］的干燥根，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，藥用歷史已有2000多年［1］；2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》一部中收載的含黃芪中藥制劑多達(dá)163 個(gè)［2］。中醫(yī)認(rèn)為黃芪味甘，性微溫，具有益氣養(yǎng)元、養(yǎng)心通脈、祛邪扶正等功效。臨床實(shí)踐中，黃芪飲片、提取物及復(fù)方制劑被廣泛用于治療冠心病、心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、腦梗死等心腦血管疾病［3-4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明［5-8］，黃芪通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）促進(jìn)心肌細(xì)胞脂肪酸β 氧化，提高心臟能量供應(yīng)，改善心力衰竭；可上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT4）及與葡萄糖代謝相關(guān)酶的表達(dá)改善2型糖尿病的糖耐量受損癥狀；可降低膽固醇合成關(guān)鍵酶HMG-CoA 的表達(dá)抑制膽固醇的合成緩解高脂血癥的癥狀；可抑制β-分泌酶（BACE1）活性，降低β-淀粉樣多肽在阿爾茨海默病腦中的蓄積。目前，關(guān)于黃芪“修心護(hù)腦”作用的研究大多從分子藥理學(xué)角度開展，聚焦于一些經(jīng)典的信號(hào)通路，而對(duì)黃芪作用后機(jī)體循環(huán)血液及心腦等靶器官的代謝應(yīng)答情況則鮮有研究。

代謝組學(xué)是一門利用現(xiàn)代分析技術(shù)，研究生物體受環(huán)境、疾病、藥物等因素影響后內(nèi)源性代謝物數(shù)量、種類及其變化規(guī)律的新興學(xué)科［9］。中藥多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)給中藥現(xiàn)代化研究帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)，而代謝組學(xué)的系統(tǒng)生物學(xué)特點(diǎn)與中藥的整體觀相符合，為中藥現(xiàn)代化研究提供了方向性新手段［10］。目前，代謝組學(xué)已在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制、中藥復(fù)方研究及中藥安全性評(píng)價(jià)等方面得到了廣泛運(yùn)用［11-12］。本研究旨在整合運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）技術(shù)，全面表征小鼠灌胃給予黃芪后心腦血管系統(tǒng)代謝穩(wěn)態(tài)的變化，篩選差異代謝物并探討黃芪發(fā)揮保護(hù)心腦血管作用的潛在機(jī)制。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

黃芪飲片（產(chǎn)地：甘肅，安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司）；甲醇和乙腈（HPLC 級(jí)，德國(guó)Merck 公司）；甲酸（HPLC 級(jí)，美國(guó)ROE Scientific 公司）；乙酸乙酯（分析純，南京化學(xué)試劑公司）；氯化鈉注射液（安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司）；甲氧胺（MOX，純度大于99.9%）、N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（MSTFA，純度大于98.5%）、吡啶（純度大于99.9%）、內(nèi)標(biāo)（十七酸，格列本脲，純度大于99.9%）以及代謝物標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 黃芪水提液制備

黃芪飲片經(jīng)球磨機(jī)打粉后稱取粉末10 g，按質(zhì)量體積比1∶10（g∶mL）加入超純水煎煮2 次，每次2 h，煎煮液經(jīng)紗布過(guò)濾、合并濾液，凍干后保存于-80 ℃冰箱。每次灌胃前用超純水新鮮配制質(zhì)量濃度為1 g/mL的黃芪水提取液（以生藥含量計(jì)）。

1.3 儀 器

超快速液相色譜-離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UFLC-IT-TOF/MS）、GCMS-QP2010 Ultra 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；5430R 冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；TMS-200 超級(jí)恒溫混勻儀（杭州奧盛公司）；低溫恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)浴（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司）；離心濃縮儀、冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Labconco 公司）；Milli-Q 超純水制備系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.4 動(dòng) 物

SPF級(jí)ICR小鼠13只，雄性，體重（18～22）g，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（許可證：SCXK（蘇）2016-0010），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循中國(guó)藥科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理方法》等相關(guān)規(guī)定。小鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，每日光照12 h，溫度20～25 ℃，濕度40%～50%，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲用水。

2 方 法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及樣本采集

適應(yīng)環(huán)境1 周后，隨機(jī)分為對(duì)照組（Con，6 只）和黃芪組（AR，7 只）。AR 組連續(xù)灌胃給予黃芪水提液10 d，劑量為20 mL/（kg·d）（以生藥含量計(jì)），Con 組灌胃給予同等體積生理鹽水。最后一次灌胃結(jié)束后24 h，麻醉取血清，處死后取心臟和腦組織，所有樣本于-80 ℃凍存。

2.2 樣品制備

2.2.1 組織勻漿液 取腦或心臟組織100 mg 并剪碎，加80%甲醇（甲醇-水，8∶2）800 μL 勻漿，以6.5 m/s速度勻漿10 s，間隔30 s，重復(fù)3次。

2.2.2 LC-MS 分析前處理 樣本室溫解凍后渦旋10 s，取血清或組織勻漿液20μL，分別加沉淀試劑（甲醇-乙腈，1∶1，含內(nèi)標(biāo)格列本脲5μg/mL）140或100μL，渦旋后兩次離心取上清液，用于LC-MS分析。

2.2.3 GC-MS分析前處理 取血清10μL 或組織勻漿液50 μL，加甲醇（含內(nèi)標(biāo)十七酸10 μg/mL）100 或50 μL，渦旋15 min 后，兩次離心取上清液80 μL，加MOX（10 mg/mL）25 μL，37 ℃孵 育90 min，真空干燥，加MSTFA 120μL，37 ℃反應(yīng)2 h后，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶用于GC-MS分析。

2.2.4 質(zhì)控樣本制備 為保證分析結(jié)果的可靠性，分別從每只動(dòng)物的血清、心臟和腦組織勻漿液中吸取等體積的樣品混勻后制得質(zhì)控（QC）樣本。大批量分析時(shí)，每間隔4 個(gè)待分析樣本插入一個(gè)QC樣本，同法處理分析。

2.3 儀器分析條件

2.3.1 LC-MS 分析條件 色譜柱為XSelect HSS T3 XP（2.1 mm×100 mm，2.5 μm，美國(guó)Waters 公司），0.01%甲酸水溶液（A 相）和乙腈（B 相）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。梯度洗脫程序如下：0.00～4.00 min，95%～50% A；4.0～10.00 min，50%～15% A；10.00～15.00 min，15%～0% A；15.00～20.00 min，0% A；20.00～20.01 min，0%～95% A；20.01～30.00 min，95%A。流速：0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5μL。質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI）正負(fù)離子切換模式進(jìn)行檢測(cè)，毛細(xì)管電壓分別為+4.5 和-3.5 kV；鞘氣（氮?dú)猓毫Γ?5 arb；輔助氣（氮?dú)猓毫Γ?5 arb；離子傳輸毛細(xì)管加熱溫度：320 ℃；全掃描的質(zhì)量范圍為100～1 000m/z，掃描時(shí)間為0.2 s。

2.3.2 GC-MS 分析條件 采用分流進(jìn)樣模式（血清樣本分流比為20∶1，組織勻漿液樣本分流比為50∶1），進(jìn)樣量1 μL。色譜柱為Rtx-5MS（30 m ×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，流速為1 mL/min。色譜柱升溫程序?yàn)?0 ℃保持2 min 后，以10 ℃/min 的速度加熱至320 ℃后再保持3 min。進(jìn)樣口、接口、離子源的溫度分別設(shè)置為250、200、250 ℃。電離方式為電子轟擊離子源（EI），電壓為70 eV，掃描范圍為45～600m/z。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

LC-MS 和GC-MS 數(shù)據(jù)分別經(jīng)Profiling Solution軟件（日本Shimadzu 公司）進(jìn)行峰提取和峰匹配后生成由質(zhì)荷比-保留時(shí)間-離子峰強(qiáng)度構(gòu)成的三維數(shù)據(jù)矩陣。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行扣空白、峰過(guò)濾、缺失值填補(bǔ)、總面積歸一化等預(yù)處理后，導(dǎo)入SIMCA-P 軟件（Version 13.0，瑞典Umetrics 公司）進(jìn)行正交轉(zhuǎn)換偏最小二乘法判別（OPLS-DA）分析，計(jì)算變量投影重要性參數(shù)（VIP）。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 軟件（Version 17.0，美國(guó)IBM公司），進(jìn)行兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U 檢驗(yàn)）。同時(shí)滿足VIP＞1、P＜0.05 以及絕對(duì)變化倍數(shù)（|FC|＞1.2 的變量即為差異變量。依據(jù)保留時(shí)間、質(zhì)譜裂解碎片等信息，與HMDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//hmdb. ca/）、NIST 譜庫(kù)以及標(biāo)準(zhǔn)品圖譜進(jìn)行比對(duì)，鑒定差異變量。所得差異代謝物輸入到在線處理軟件MetPA（https：//www.metaboanalyst.ca/）中進(jìn)行富集分析，并結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genome.jp/kegg/）繪制代謝通路圖。

3 結(jié) 果

3.1 數(shù)據(jù)可靠性考察

從血清、心臟、腦組織的LC-MS 原始圖譜中分別提取出2 951，2 395 和1 912 個(gè)離子；從GC-MS譜圖中導(dǎo)出2 802，2 336 和2 441 個(gè)離子。經(jīng)計(jì)算比較發(fā)現(xiàn)，QC 樣本的譜圖重疊性較高（圖1），超過(guò)90%的離子峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于30%。說(shuō)明本研究采用的分析方法及過(guò)程穩(wěn)定、可靠，所得數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步的分析。

Figure 1 Total ion chromatography(TIC)of representative QC samples

3.2 差異代謝物篩選鑒定及代謝通路分析

OPLS-DA 分析結(jié)果如圖2 所示。3 種生物樣本中，AR 組和Con 組均區(qū)分明顯（LC-MS 模型參數(shù)：血清——R2X=0.517，R2Y=0.990，Q2=0.689；心臟組織——R2X=0.463，R2Y=0.981，Q2=0.641；腦組織——R2X=0.632，R2Y=0.998，Q2=0.842。GCMS模型參數(shù)：血清——R2X=0.541，R2Y=0.979，Q2=0.597；心臟組織——R2X=0.486，R2Y=0.998，Q2=0.967；腦 組 織——R2X=0.882，R2Y=0.979，Q2=0.763）。上述結(jié)果說(shuō)明黃芪對(duì)小鼠血清、心臟和腦中的代謝物組都產(chǎn)生了顯著影響。

Figure 2 OPLS-DA score plots of serum,heart and brain samples from control（Con）and AR treated mice

從血清、心臟、腦組織中分別鑒定出15、19 和17個(gè)差異代謝物（表1和表2）。經(jīng)3種生物樣本間比較分析，結(jié)果如圖3 所示，差異代謝物棕櫚酸和LysoPC（20∶3）為所有生物樣本共有，且含量變化趨勢(shì)一致：與對(duì)照組相比，棕櫚酸顯著下降，LysoPC（20∶3）顯著升高。此外，甘氨酸為心臟與血清共有差異代謝物，含量均顯著增加；絲氨酸、苯丙氨酸為腦與血清共有，絲氨酸均顯著增加，苯丙氨酸變化趨勢(shì)則相反；油酸、硬脂酸、LysoPE（20∶4）、LysoPC（18∶0）為腦與心臟共有，油酸、硬脂酸在兩組織中均呈下降趨勢(shì)，而LysoPE（20∶4）、LysoPC（18∶0）在心臟中均顯著增加，在腦中則顯著降低，變化趨勢(shì)則相反。

整合鑒定出的40 個(gè)差異代謝物，進(jìn)行代謝通路富集分析（圖3-C），發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝、脂肪酸代謝等途徑變化顯著。在此基礎(chǔ)上，初步構(gòu)建了小鼠心腦血管系統(tǒng)受黃芪水煎液影響的代謝網(wǎng)絡(luò)（圖4）。

Table 1 Differential metabolites in serum, heart and brain samples detected by LC/MS

4 討 論

經(jīng)黃芪干預(yù)后，小鼠血清、心臟、腦的代謝變化主要涉及氨基酸代謝、脂代謝與能量代謝。脂代謝涉及的物質(zhì)主要包括溶血磷脂酰膽堿類（LPCs）、不飽和脂肪酸（UFA）及飽和脂肪酸（SFA）。LPCs 類物質(zhì)可激活PPARδ，上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT4 的表達(dá)，維持脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性［13］。氧化應(yīng)激損傷破壞神經(jīng)元細(xì)胞膜，會(huì)導(dǎo)致側(cè)鏈為不飽和脂肪酸的LPCs類物質(zhì)含量顯著下降［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組，AR 組小鼠血清中LysoPC（16∶1）、LysoPC（18∶1）、LysoPC（20∶3）、LysoPC（20∶4）含量顯著升高；AR 組小鼠腦中LysoPC（20∶3）和LysoPC（22∶6）水平上升，提示黃芪可能通過(guò)改善磷脂代謝提高機(jī)體胰島素敏感性與緩解氧化應(yīng)激造成的腦神經(jīng)元損傷。

Table 2 Differential metabolites in serum, heart and brain samples detected by GC/MS

UFA 在防治心腦血管疾病方面發(fā)揮重要作用，自由基氧化造成的血清UFA 含量下降，易誘發(fā)高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等血管疾?。?7-18］。AR 組小鼠血清中3 種UFA：棕櫚油酸、二十二碳六烯酸（DHA）和亞油酸（LA）含量上升，提示黃芪可通過(guò)抗氧化效應(yīng)調(diào)節(jié)UFA 穩(wěn)態(tài)而發(fā)揮改善血管疾病的作用。黃芪中的活性成分黃芪甲苷可以激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活型受體α（PPARα），促進(jìn)脂肪酸β-氧化，增強(qiáng)供能［5］。脂肪酸是心肌細(xì)胞主要能量代謝底物，有研究發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌梗死模型動(dòng)物心臟中長(zhǎng)鏈脂肪酸β-氧化受損，發(fā)生蓄積［19］。AR 組小鼠心臟中棕櫚酸、油酸、硬脂酸含量呈下降趨勢(shì)，提示黃芪可通過(guò)改善脂肪酸代謝治療心臟疾病。

Figure 3 A：Heat-map of the differential metabolites in mice serum,heart and brain;B：Venn diagram;C：Results of metabolic pathway enrichment

Figure 4 Effect of Astragalus on the metabolic homeostasis of the cardio-cerebrovascular system in mice

氨基酸不僅參與機(jī)體的能量代謝與蛋白質(zhì)合成，還可合成多種生理活性物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，血中Gly 和苯丙氨酸（Phe）可作為早期預(yù)測(cè)T2DM 發(fā)生的生物標(biāo)志物，胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致患者血清中Gly 水平顯著降低，Phe 含量增加［13，19］。本研究中AR 組小鼠血清中Gly含量上升，Phe含量降低的趨勢(shì)提示黃芪可通過(guò)調(diào)節(jié)Gly 與Phe 代謝降低罹患T2DM 的風(fēng)險(xiǎn)。谷氨酸（Glu）是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。疾病狀態(tài)下Glu 大量釋放，會(huì)過(guò)度激活受體導(dǎo)致神經(jīng)元興奮、病變，產(chǎn)生興奮性毒性，目前研究發(fā)現(xiàn)，Glu 大量釋放是多種腦部疾病的病理特征之一，包括腦缺血、AD、創(chuàng)傷性腦損傷等［20-22］。酪氨酸（Tyr）是合成兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素和多巴胺的重要前體，可以增強(qiáng)認(rèn)知靈活性與記憶功能，具有改善認(rèn)知障礙的潛力［23］。Ser 可促進(jìn)細(xì)胞增殖，合成抗氧化劑谷胱甘肽與神經(jīng)遞質(zhì)牛磺酸［24］。與對(duì)照組相比，AR 組小鼠腦組織中Glu 含量降低，Tyr、Ser、Phe 含量增加，提示黃芪可調(diào)節(jié)多種氨基酸代謝，維持腦神經(jīng)遞質(zhì)穩(wěn)態(tài)而發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)。

大腦主要以葡萄糖供能，充足的糖代謝對(duì)維持大腦正常生理功能十分重要。AR 組小鼠血清中葡萄糖的減少，腦中檸檬酸/異檸檬酸、琥珀酸水平的升高，反映了黃芪可提高腦中三羧酸循環(huán)代謝速率，增強(qiáng)能量供應(yīng)。L-肉堿在心臟脂肪酸代謝中十分關(guān)鍵，它作為一種載體將脂肪酸從線粒體膜外轉(zhuǎn)運(yùn)至膜內(nèi)進(jìn)行β-氧化［25］，黃芪干預(yù)后小鼠心臟中L-肉堿含量降低，進(jìn)一步提示黃芪可促進(jìn)脂肪酸代謝，提高心臟能量供應(yīng)。

本研究整合運(yùn)用基于色譜-質(zhì)譜技術(shù)的非目標(biāo)代謝組學(xué)方法，考察小鼠灌胃給予黃芪水提液后機(jī)體的代謝變化，在血清、心臟、腦中分別發(fā)現(xiàn)了15、19、17 個(gè)差異代謝物，并聚焦于氨基酸代謝、脂類代謝及能量代謝等通路，從代謝調(diào)控角度初步闡明了黃芪“修心護(hù)腦”的作用機(jī)制。