蘇 喆，周朝東，馬 冰，張 晶，伏圣青，王 沖，稅鳳春，黃哲甦

（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津300070）

鹿瓜多肽注射劑包括鹿瓜多肽注射液和注射用鹿瓜多肽，屬于多組分生化藥。鹿瓜多肽注射劑是從動(dòng)物梅花鹿骨骼和中草藥甜瓜子中分離、提取制成的滅菌水溶液或無(wú)菌凍干品。無(wú)菌凍干品的輔料為甘露醇或右旋糖酐40。鹿瓜多肽注射劑的主要成分鹿骨提取物中含有骨誘導(dǎo)多肽、多種游離氨基酸，以及鈣、磷等活性因子，可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)骨折愈合；甜瓜子提取物富含多肽、不飽和脂肪酸，可以降低毛細(xì)血管通透、減少炎性滲出，有效緩解各種炎性癥狀。鹿瓜多肽注射劑臨床上主要用于風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、各種類(lèi)型骨折、創(chuàng)傷修復(fù)等［1］。

目前鹿瓜多肽注射劑在我國(guó)共有3 家企業(yè)生產(chǎn)，7 個(gè)國(guó)藥準(zhǔn)字批準(zhǔn)文號(hào)?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)包括：國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS1-XG-002-2002-2005、試行標(biāo)準(zhǔn)YBH12682005（8 mg）/ YBH12432006（16 mg）/YBH13522006（24 mg）、試行標(biāo)準(zhǔn)YBH13342005及補(bǔ)充申請(qǐng)批件2006B01192。歷版《中華人民共和國(guó)藥典》及國(guó)外藥典均未收載鹿瓜多肽注射劑。

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局將鹿瓜多肽注射劑列入2019 年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)計(jì)劃，隸屬于多組分生化藥專(zhuān)項(xiàng)。此次國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品監(jiān)督管理司共抽樣鹿瓜多肽注射劑69 批次，其中注射用鹿瓜多肽有4、8、16 和24 mg 4 種規(guī)格；鹿瓜多肽注射液有2 mL∶4 mg和4 mL∶8 mg兩種規(guī)格。

在對(duì)生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行實(shí)地調(diào)研及樣品法定檢驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)了如下問(wèn)題：（1）現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)暫無(wú)樣品新鮮度質(zhì)控項(xiàng)目。現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研時(shí)發(fā)現(xiàn)甜瓜子原料存在霉變、酸敗的現(xiàn)象，中間提取液存在反復(fù)凍融的情況，且企業(yè)未對(duì)生物胺、真菌毒素、酸價(jià)及過(guò)氧化值等影響產(chǎn)品新鮮度的指標(biāo)進(jìn)行控制；（2）現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS1-XG-002-2002-2005 未對(duì)高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)進(jìn)行控制；其余質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均采用凝膠色譜法測(cè)定高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)。經(jīng)法定檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于制劑成分非常復(fù)雜，色譜流出峰難以有效分離，對(duì)積分和定量都造成一定困難，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確；（3）現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)缺失溶血與凝聚、生物學(xué)活性測(cè)定項(xiàng)目，無(wú)法從安全性、有效性方面控制產(chǎn)品質(zhì)量；（4）現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用福林酚法測(cè)定多肽含量，該法存在輔料干擾、對(duì)照品和供試品溶解稀釋所用溶劑不一致的情況?；谏鲜鰡?wèn)題，本研究開(kāi)展一系列探索，包括建立新鮮度質(zhì)量屬性的檢測(cè)項(xiàng)目、優(yōu)化高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)和多肽含量測(cè)定檢測(cè)方法、考察溶血與凝聚及生物學(xué)活性測(cè)定，從安全性、有效性角度系統(tǒng)研究鹿瓜多肽注射劑的質(zhì)量狀況，以期為鹿瓜多肽注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善奠定理論基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

8 種生物胺對(duì)照品，包括：組胺、酪胺、尸胺、腐胺、2-苯乙胺、色胺、精胺、亞精胺（純度均大于98.0%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液（批號(hào)LC01086，含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2質(zhì) 量 濃 度 分 別 為：0.961、0.280、0.903、0.296μg/mL，美國(guó)Supelco公司）；黃曲霉毒素免疫親和柱（AflaTest，1 mL，美國(guó)Vicam 公司）；核糖核酸酶A（批號(hào)E1624067，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；超低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker（3.3-20.1 kD，北京索萊寶科技有限公司）；Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay 多肽含量測(cè)定試劑盒（批號(hào)UD286404C，美國(guó)Thermo Fisher 公司）；牛血清白蛋白（批號(hào)SLBC3968V，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號(hào)0022919，以色列Biological Industries 公司）；胎牛血清（FBS）（批號(hào)1913445，以色列Biological Industries 公司）；CCK-8 試劑盒（批號(hào)NY652，日本同仁化學(xué)研究所）；乙腈、甲醇為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore 超純水；其余試劑均為市售分析純。鹿瓜多肽注射劑均為2019年國(guó)家藥品抽驗(yàn)計(jì)劃樣品（69 批，來(lái)自3 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)）；鹿瓜多肽中間提取液、甜瓜子原料均由3個(gè)生產(chǎn)企業(yè)提供。

1.2 儀 器

Waters e2695 高效液相色譜系統(tǒng)，配2489 UV/Vis 紫外檢測(cè)器、Aura Industries 光化學(xué)衍生器（254 nm紫外燈衍生光源）及2475 FLR熒光檢測(cè)器（美國(guó)Waters 公司）；T50 自動(dòng)電位滴定儀、XS205電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Mini-Protean Tetra 垂直電泳系統(tǒng)及Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Varioskan Flash 多功能酶標(biāo)儀、HERAcell 240i 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；CF16RXII 冷凍離心機(jī)（日本Hitachi 公司）；R-215 專(zhuān)業(yè)型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；ECLIPSE TS100-F 倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；SpectraMax M2 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）；純化水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 細(xì)胞株

人髓系白血病單核細(xì)胞株（THP-1），購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，定期傳代。

1.4 動(dòng) 物

家兔（2.5～3.3 kg，普通級(jí)）購(gòu)自天津裕達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司，合格證號(hào)：0010784。

2 方 法

2.1 生物胺的測(cè)定

生物胺是食品或藥材新鮮程度和被微生物污染程度的標(biāo)志［2］。本研究以丹磺酰氯為衍生試劑，衍生化RP-HPLC 法測(cè)定鹿瓜多肽注射劑中的生物胺類(lèi)成分。

2.1.1 溶液的制備 對(duì)照品溶液：取8 種生物胺對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，分別置10 mL量瓶中，用0.1 mol/L 鹽酸溶液制成每1 mL 中約含各生物胺2.5 mg 的溶液，作為對(duì)照品貯備液。分別量取各生物胺對(duì)照品貯備液1.0 mL，置同一25 mL 量瓶中，用0.1 mol/L 鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，制得生物胺混合對(duì)照品溶液（0.1 mg/mL）；精密量取此混合對(duì)照品溶液0.01，0.10，0.50，1.00，2.00，5.00 mL，分別置10 mL 量瓶中，用0.1 mol/L 鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，制得0.10，1.00，5.00，10.00，20.00，50.00 μg/mL 的系列混合對(duì) 照 品溶液。

供試品溶液：取鹿瓜多肽注射液（A 企業(yè)），作為供試品溶液；取注射用鹿瓜多肽（B、C 企業(yè)），用0.1 mol/L 鹽酸溶液溶解并稀釋制成2 mg/mL 的溶液（以多肽計(jì)），作為供試品溶液。

空白溶劑：取0.1 mol/L 鹽酸溶液，作為空白溶劑。

衍生劑溶液：精密稱(chēng)取丹磺酰氯適量，用丙酮制成10 mg/mL的溶液，作為衍生劑溶液。

精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶劑各0.5 mL，依次加入衍生劑溶液1 mL、飽和碳酸氫鈉溶液0.3 mL 與氫氧化鈉溶液（2 mol/L）0.2 mL，60 ℃水浴避光反應(yīng)30 min，取出加入氨水（1∶1）0.2 mL，室溫避光反應(yīng)30 min，加乙酸乙酯5 mL 提取3次，合并提取液，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑蛹状?.0 mL 溶解殘留物，用0.22μm 有機(jī)濾膜濾過(guò)，進(jìn)行HPLC測(cè)定。

2.1.2 色譜條件 采用Inertsil ODS-3 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以水（A）-90%乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～30 min，50%B→100%B；30～38.5 min，100% B；38.5～39 min，100% B→50% B；39～43 min，50% B），檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量30μL。

2.1.3 專(zhuān)屬性 取生物胺混合對(duì)照品溶液（10μg/mL）、供試品溶液（批號(hào)120180407）和空白溶劑分別進(jìn)行衍生，并進(jìn)樣分析。

2.1.4 線性關(guān)系、定量限及檢測(cè)限 精密量取衍生后的系列混合對(duì)照品溶液各30μL進(jìn)樣分析，以8 種生物胺質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，各生物胺的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察各生物胺的線性關(guān)系。取上述衍生后的混合對(duì)照品溶液用甲醇適當(dāng)稀釋?zhuān)孕旁氡萐/N=10 和S/N=3 分別作為定量限和檢測(cè)限。

2.1.5 回收率 取批號(hào)為220190106 的供試品溶液0.25 mL，共制9 份，分成3 組。分別精密加入1.00、5.00、10.00 μg/mL 混合對(duì)照品溶液0.25 mL，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 份，分別衍生后進(jìn)樣分析。

2.1.6 精密度 取混合對(duì)照品溶液（10 μg/mL）0.5 mL進(jìn)行衍生反應(yīng)，平行制備6份，進(jìn)樣分析。

2.1.7 樣品測(cè)定 取3 個(gè)廠家的樣品按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液及對(duì)照品溶液并分別進(jìn)行衍生反應(yīng)，按照“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各生物胺的含量。

2.2 黃曲霉毒素的測(cè)定

按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015 年版）四部通則2351黃曲霉毒素測(cè)定法指導(dǎo)原則及相關(guān)的文獻(xiàn)［3-4］，建立了鹿瓜多肽注射劑及中間提取液中黃曲霉毒素的HPLC 柱后光化學(xué)衍生測(cè)定方法。采用Phenomenex Luna C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），熒光檢測(cè)器（激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm），以甲醇-乙腈-水（30∶15∶55）為流動(dòng)相，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量50μL。將適宜濃度的黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液、鹿瓜多肽注射劑樣品溶液及中間提取液分別通過(guò)免疫親和柱，流速為每秒1～2滴，用水20 mL 洗脫，棄去洗脫液，使空氣進(jìn)入柱子，最后用甲醇洗脫并進(jìn)樣分析。

2.3 甜瓜子原料酸價(jià)及過(guò)氧化值的測(cè)定

參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中酸價(jià)的測(cè)定（GB 5009.229－2016）》及《食品中過(guò)氧化值的測(cè)定（GB 5009.227－2016）》，對(duì)甜瓜子原料（A 企業(yè)3 批，B 企業(yè)5 批）的酸價(jià)、過(guò)氧化值進(jìn)行檢測(cè)。首先將甜瓜子粉碎，用水?dāng)噭虿⒔?～3 h；再加入石油醚，浸泡過(guò)夜；經(jīng)裝有無(wú)水硫酸鈉的濾紙過(guò)濾，取濾液置圓底燒瓶中，在40 ℃水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干石油醚，殘留物即為待測(cè)油脂；用滴定法測(cè)定待測(cè)油脂的酸價(jià)和過(guò)氧化值。酸價(jià)測(cè)定采用乙醇制氫氧化鉀滴定液（0.1 mol/L）進(jìn)行電位滴定；過(guò)氧化值測(cè)定采用硫代硫酸鈉滴定液（0.002 mol/L）進(jìn)行電位滴定。

2.4 高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)

參考相關(guān)文獻(xiàn)［5-6］，進(jìn)行條件優(yōu)化后采用Tricine-SDS-PAGE 電泳法測(cè)定鹿瓜多肽注射劑的高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)。優(yōu)化后的電泳條件為：16.5%的分離膠，10%的積層膠，4%的濃縮膠；陽(yáng)極緩沖液為T(mén)ris-HCl緩沖液（pH 8.9），陰極緩沖液為T(mén)ris-Tricine-SDS 緩沖液；染色液為甲醇-冰醋酸-水（200∶50∶250）、含0.2%考馬斯亮藍(lán)R-250；脫色液為0.5 mol/L 氯化鈉溶液。實(shí)驗(yàn)時(shí)先用Tricine-SDS-PAGE 分離供試品溶液中的多肽成分，然后用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色，對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量大于5 800的高相對(duì)分子質(zhì)量蛋白進(jìn)行定量。精密稱(chēng)取核糖核酸酶A 適量，加水溶解并稀釋制成含核糖核酸酶A 800，600，400，200，100 μg/mL 的系列溶液，作為蛋白對(duì)照品溶液1～5。以蛋白對(duì)照品溶液1～5 的蛋白含量為橫坐標(biāo)，灰度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得出線性方程。根據(jù)供試品溶液中蛋白條帶的灰度值計(jì)算出供試品中高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的含量。

2.5 溶血與凝聚

取家兔耳動(dòng)脈血，按《中華人民共和國(guó)藥典》（2015 年版）四部通則1148 溶血與凝聚檢查法制備2%紅細(xì)胞懸液，69 批鹿瓜多肽注射劑均按照2 mg/mL 多肽含量制備供試品溶液，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組（氯化鈉注射液）和陽(yáng)性對(duì)照組（滅菌注射用水）。采用直接觀察法（試管內(nèi)肉眼觀察）考察受試物管中的溶液在3 h 內(nèi)是否發(fā)生溶血和凝聚反應(yīng)，直接觀察法結(jié)束后，將供試品和對(duì)照組均以2 000 r/min 離心5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定上清液在545 nm波長(zhǎng)處的吸收度。每管加樣3個(gè)復(fù)孔，求其平均值。按公式［溶血率=（供試品管吸收度－陰性對(duì)照管吸收度）/（陽(yáng)性對(duì)照管吸收度－陰性對(duì)照管吸收度）×100%］計(jì)算溶血率，以溶血率大于5%表示有溶血發(fā)生。

2.6 多肽含量測(cè)定

多肽含量測(cè)定試劑盒基于《中華人民共和國(guó)藥典》（2015 年版）四部通則0731 蛋白質(zhì)含量測(cè)定第四法（BCA 法）測(cè)定原理，對(duì)照品貯備液為牛血清白蛋白溶液，用水配制成下列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液：500、250、125、62.5、31.25、15.625 和0μg/mL，按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作并用酶標(biāo)儀在480 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。鹿瓜多肽注射劑用水溶解并稀釋制成250 μg/mL（以多肽計(jì)）的溶液，作為供試品溶液。將供試品溶液的平均吸收度代入上述對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算出供試品溶液的多肽含量。

2.7 生物學(xué)活性測(cè)定

針對(duì)鹿瓜多肽注射劑的抗炎作用，并參考相關(guān)文獻(xiàn)［7-8］，采用CCK-8 法考察鹿瓜多肽注射劑抑制THP-1 細(xì)胞增殖的作用，以此評(píng)價(jià)其生物學(xué)活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔0.1 mL 接種于96 孔板，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，然后以每孔0.1 mL 加入不同質(zhì)量濃度的鹿瓜多肽注射劑受試物溶液，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)制備陰性對(duì)照組（不加受試物溶液，加入同體積的培養(yǎng)基）和空白組（不加細(xì)胞孔）。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h。終止培養(yǎng)前4 h，每孔加入CCK-8 溶液10μL，作用4 h 后，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，按公式［抑制率=（陰性對(duì)照組平均吸收度－空白吸收度）/（受試物組平均吸收度－空白吸收度）×100%］計(jì)算抑制率，以此評(píng)價(jià)鹿瓜多肽注射劑對(duì)THP-1 細(xì)胞的增殖抑制作用。

3 結(jié) 果

3.1 生物胺的測(cè)定

3.1.1 系統(tǒng)適用性和專(zhuān)屬性 取空白溶劑、混合對(duì)照品溶液（10μg/mL）和供試品溶液分別衍生后進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，該方法專(zhuān)屬性良好，空白溶劑在目標(biāo)峰出峰位置無(wú)干擾，各生物胺色譜峰理論塔板數(shù)均大于10 000，各相鄰峰的分離度均大于1.5，色譜圖見(jiàn)圖1。

Figure 1 HPLC chromatogram of blank solution(A),reference solution(B)and sample test solution(C)of Cervus and Cucumis polypeptide injection

3.1.2 線性關(guān)系、定量限及檢測(cè)限考察 8 種生物胺均在0.10～50.00 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；各生物胺的定量限在0.031～0.112 μg/mL 之間；檢測(cè)限在0.009～0.034 μg/mL 之間，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.1.3 回收率試驗(yàn) 結(jié)果顯示8種生物胺的平均回收率在90.71%～97.88%之間，RSD在0.55%～2.04%之間，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.1.4 精密度試驗(yàn) 結(jié)果組胺、色胺、2-苯乙胺、腐胺、酪胺、尸胺、亞精胺、精胺8 種生物胺的衍生物峰面積RSD（n=6，%）分別為0.73、0.21、0.47、0.47、1.01、1.32、0.23、0.81，表明色譜系統(tǒng)精密度良好。

3.1.5 樣品檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，A 企業(yè)和C 企業(yè)的鹿瓜多肽注射劑檢出組胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺等生物胺，但含量均較低（0.004%～0.038%，占多肽標(biāo)示量的百分比計(jì)）；而B(niǎo) 企業(yè)的10 批鹿瓜多肽注射劑均檢出較高濃度的尸胺，范圍從0.265%～0.333%。各樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

Table 1 Results of methodological validation tests for the content determination of biogenic amines

Table 2 Concentration of biogenic amines in 22 batches samples of Cervus and Cucumis polypeptide injection

3.2 黃曲霉毒素的測(cè)定

選取3 個(gè)企業(yè)共30 批鹿瓜多肽注射劑和8 批甜瓜子提取液進(jìn)行了黃曲霉毒素的測(cè)定，結(jié)果上述38 批樣品均未檢出黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢測(cè)限分別為0.012、0.003 4、0.011、0.003 6 ng/mL）。

3.3 甜瓜子原料酸價(jià)及過(guò)氧化值的測(cè)定

通過(guò)對(duì)兩個(gè)企業(yè)共8批甜瓜子原料進(jìn)行測(cè)定，過(guò)氧化值測(cè)定結(jié)果在0.004～0.014 g/100 g 之間，低于國(guó)標(biāo)GB 19300－2014 的限值0.40 g/100 g。而酸價(jià)結(jié)果差異較大，在1.92～7.26 mg/g 之間（以KOH 計(jì)），其中A 企業(yè)批號(hào)為20180901 的甜瓜子原料酸價(jià)為7.26 mg/g，B 企業(yè)批號(hào)為1901002和1902003 的甜瓜子原料酸價(jià)分別為3.14 和3.06 mg/g，均超過(guò)國(guó)標(biāo)GB 19300－2014 的限值3.0 mg/g。

3.4 高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的考察

凝膠色譜法測(cè)定高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)操作簡(jiǎn)便，但對(duì)于成分復(fù)雜的多組分生化藥并不適用。鹿瓜多肽注射劑色譜流出峰難以有效分離，對(duì)積分和定量都造成一定困難（圖2），導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。

Figure 2 SEC-HPLC chromatogram of reference substance (A, relative molecular weight 5 800) and test sample (B, batch No. 181018) of Cervus and Cucumis polypeptide injection

為了尋找比凝膠色譜法更準(zhǔn)確的測(cè)定方法，探索性研究嘗試了Tricine-SDS-PAGE 電泳（圖3）。因A 企業(yè)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中暫無(wú)高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)檢查項(xiàng)，故隨機(jī)抽取A 企業(yè)的10 批樣品進(jìn)行高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。以對(duì)照品溶液1～5 的蛋白含量為橫坐標(biāo)，以掃描灰度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，相關(guān)系數(shù)r值均大于0.98；10 批鹿瓜多肽注射劑樣品高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)含量平均值為16.36%。另經(jīng)測(cè)定，B、C 企業(yè)的高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)含量均低于2.0%。綜上，提示A企業(yè)應(yīng)進(jìn)一步改進(jìn)超濾工藝，降低高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的含量，從而提高產(chǎn)品的安全性。

Figure 3 Tricine-SDS-PAGE gel electrophotogram of high molecular weight substance of Cervus and Cucumis Polypeptide Injection (batch No. 181018)

Table 3 Results of high molecular weight substance of Cervus and Cucumis polypeptide injection by Tricine-SDS-PAGE

3.5 溶血與凝聚測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有批次供試品溶液和陰性對(duì)照管均無(wú)溶血與凝聚現(xiàn)象；經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定并計(jì)算溶血率，結(jié)果所有供試品溶液溶血率均在5%以下，表明本品無(wú)體外溶血作用。

3.6 多肽含量測(cè)定

試劑盒法測(cè)定多肽含量的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，多肽在15.63～1 000 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸收度呈良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率為99.4%，RSD 為3.0%（n=9）；最低檢測(cè)限為15.63μg/mL。

按法定標(biāo)準(zhǔn)福林酚法檢驗(yàn)全部69 批次樣品，結(jié)果多肽含量合格率為100%。但由于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了含量測(cè)定值的下限而未設(shè)定上限，不符合藥品質(zhì)量控制要求。擬將含量限度統(tǒng)一修訂為“含多肽以牛血清白蛋白計(jì)，應(yīng)為標(biāo)示量的80%～120%”。按照修訂后的限度規(guī)定，用福林酚法和試劑盒法測(cè)定69 批樣品的合格率分別為84.1%和81.2%，其中不合格樣品均是含量超上限（圖4）。

Figure 4 Results of peptide content determination of Cervus and Cucumis polypeptide injection

3.7 生物學(xué)活性測(cè)定

3.7.1 方法的建立 配制質(zhì)量濃度為0.125，0.25，0.5，1，2，4 mg/mL 的鹿瓜多肽注射劑受試物溶液，與THP-1 細(xì)胞共同孵育24、48、72 h 后測(cè)定吸收度。結(jié)果顯示，同濃度下受試物溶液隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)THP-1 細(xì)胞的抑制作用逐漸增大；在同一作用時(shí)間下，隨著受試物溶液濃度的增加，對(duì)THP-1 細(xì)胞的抑制作用亦逐漸增大。鹿瓜多肽注射劑受試物均表現(xiàn)出明顯的量效和時(shí)效關(guān)系，最終選用質(zhì)量濃度為2 mg/mL、作用時(shí)間為72 h 對(duì)隨機(jī)24 批樣品的細(xì)胞增殖抑制效果進(jìn)行比較。

3.7.2 樣品測(cè)定結(jié)果 經(jīng)探索性研究，在本實(shí)驗(yàn)條件下，A 企業(yè)樣品的抑制指數(shù)為9.6～16.8，批次之間最大差異為4.5%；B 企業(yè)樣品的抑制指數(shù)為2.4～3.4，批次之間最大差異為11.6%；C 企業(yè)樣品的抑制指數(shù)為1.4～1.9，批次之間最大差異為17.7%。3 個(gè)企業(yè)樣品在相同條件下，體外抗炎效果有一定的差異。A 企業(yè)鹿瓜多肽注射劑對(duì)THP-1 細(xì)胞的抑制作用明顯優(yōu)于B、C企業(yè)。

4 討 論

4.1 與安全性相關(guān)的檢測(cè)項(xiàng)目

4.1.1 生物胺 B 企業(yè)鹿瓜多肽注射劑中檢出高濃度的尸胺，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)［9-11］，尸胺具有致突變性，其致癌性證據(jù)尚不充分。參考人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）M7 及歐洲藥物管理局（EMEA）發(fā)布的《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》相關(guān)規(guī)定，尸胺的含量限度可以參照2類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)（致癌性未知的已知致突變性物質(zhì)）來(lái)控制。按照毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）作為評(píng)價(jià)2 類(lèi)遺傳毒性雜質(zhì)的限度要求，經(jīng)計(jì)算得知，鹿瓜多肽注射劑中含尸胺不得過(guò)0.04%［12-13］。因此，B 企業(yè)的鹿瓜多肽注射劑中尸胺含量均超過(guò)限度，提示該類(lèi)動(dòng)植物來(lái)源的多組分生化藥在原料及中間提取液的新鮮度方面應(yīng)給予重視。

4.1.2 其他安全性相關(guān)指標(biāo) 經(jīng)測(cè)定，鹿瓜多肽成品制劑及中間提取液中均未檢出黃曲霉毒素殘留，說(shuō)明終產(chǎn)品尚不存在黃曲霉毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)。但現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研時(shí)發(fā)現(xiàn)甜瓜子的霉變現(xiàn)象，可能在提取純化工藝中黃曲霉毒素被去除，或是霉變情況可能來(lái)源于其他真菌污染，如赭曲霉、青霉、鐮刀霉等，因現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研時(shí)未能及時(shí)留樣，無(wú)從考證霉變的來(lái)源，未來(lái)將繼續(xù)篩查其他真菌毒素的污染情況，進(jìn)一步提升本品的安全性。

3 家生產(chǎn)企業(yè)都有固定的甜瓜子供應(yīng)商，并對(duì)甜瓜子進(jìn)行自檢，但其內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)均未對(duì)酸價(jià)及過(guò)氧化值有要求。酸價(jià)和過(guò)氧化值在一定程度上可體現(xiàn)甜瓜子的新鮮程度［14-15］，因此有必要限量控制。甜瓜子屬于易蟲(chóng)蛀、霉變、酸敗的原料，放置溫度、濕度等都會(huì)對(duì)其品質(zhì)有所影響。調(diào)研結(jié)果顯示個(gè)別企業(yè)會(huì)一次性購(gòu)入大量同一批次的甜瓜子原料以備庫(kù)存，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，甜瓜子發(fā)生酸敗的概率也會(huì)隨之加大。因此，建議生產(chǎn)企業(yè)加強(qiáng)對(duì)甜瓜子原料的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)制訂，增加真菌毒素、酸價(jià)和過(guò)氧化值檢查項(xiàng)，并關(guān)注儲(chǔ)存條件與期限是否會(huì)對(duì)甜瓜子的品質(zhì)造成影響。

4.2 與有效性相關(guān)的檢測(cè)項(xiàng)目

4.2.1 多肽含量測(cè)定 鹿瓜多肽注射劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)均采用福林酚法測(cè)定多肽含量，對(duì)該法產(chǎn)生干擾的物質(zhì)較多，輔料右旋糖酐40 和甘露醇在測(cè)定時(shí)均產(chǎn)生一定吸收度，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確［16］。而經(jīng)試劑盒法測(cè)定，輔料甘露醇對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響；右旋糖酐40 會(huì)產(chǎn)生輕微干擾，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高。因此，無(wú)論是福林酚法還是試劑盒法，在計(jì)算含量時(shí)均應(yīng)扣除輔料對(duì)結(jié)果的貢獻(xiàn)，而試劑盒法相對(duì)于福林酚法干擾物質(zhì)較少，重復(fù)性、專(zhuān)屬性更強(qiáng)。此外，由于試劑盒法無(wú)需配制反應(yīng)試劑，且比福林酚法操作步驟少，同時(shí)采用96 孔板并通過(guò)酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，尤其適用于大批量樣品的快速測(cè)定。

4.2.2 生物學(xué)活性 臨床上，多組分生化藥起作用多為若干種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果。鹿瓜多肽注射劑的作用機(jī)制主要包括促骨細(xì)胞增殖和抗炎活性?xún)煞矫?，有研究?bào)道了基于骨細(xì)胞株的鹿瓜多肽注射劑體外活性的測(cè)定方法，該法選用大鼠骨肉瘤UMR106細(xì)胞株，考察樣品對(duì)細(xì)胞的增殖刺激作用，針對(duì)鹿瓜多肽注射劑促骨細(xì)胞增殖的作用機(jī)制來(lái)建立細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ停?7］。而本研究建立的方法選用單核巨噬細(xì)胞THP-1 作為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，考察樣品?duì)細(xì)胞的增殖抑制作用，針對(duì)其抗炎活性用于評(píng)價(jià)生物學(xué)活性，與其治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床適應(yīng)證一致，因此可以更為直觀地反映出藥品的效應(yīng)及質(zhì)量，且抑制作用明顯，操作簡(jiǎn)便，為該類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

5 總 結(jié)

本研究從生物胺的含量、黃曲霉毒素測(cè)定以及甜瓜子原料的酸價(jià)、過(guò)氧化值的考察等多角度評(píng)價(jià)了鹿瓜多肽注射劑的新鮮度，并改進(jìn)了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)和多肽含量測(cè)定的方法，同時(shí)對(duì)建議增訂項(xiàng)目溶血與凝聚、生物學(xué)活性的測(cè)定做了初步探索。通過(guò)上述工作，可以為鹿瓜多肽注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供理論依據(jù)，并為該類(lèi)多組分生化藥安全性的提升奠定基礎(chǔ)。