氧化石墨烯-海藻酸鈉-殼聚糖復(fù)合支架的制備及表征

王博蔚，馬 瑞，吳 凡，劉志輝，李凌鋒，張 驍，劉定坤，楊 楠，李美慧，楊德峰，孫 琪

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,長春130021；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院,長春130041）

腫瘤、外傷及感染等問題造成的骨組織大面積缺損嚴(yán)重影響著患者的身心健康，對(duì)臨床骨重建提出了巨大挑戰(zhàn). 作為傳統(tǒng)修復(fù)骨缺損“黃金標(biāo)準(zhǔn)”的自體骨移植技術(shù)因供體部位有限及造成患者二次創(chuàng)傷等缺點(diǎn)而應(yīng)用受限［1～3］. 近年來，骨組織工程技術(shù)的興起為骨缺損的修復(fù)帶來了希望. 該技術(shù)通過將具有適當(dāng)機(jī)械性能的可降解生物支架材料植入骨缺損部位，作為類似天然細(xì)胞外基質(zhì)的臨時(shí)模板，來促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞的黏附、增殖及成骨分化直到產(chǎn)生新生骨基質(zhì)［4］. 支架材料作為骨工程技術(shù)的核心，應(yīng)具有良好的機(jī)械性能、降解性能、適宜的孔隙結(jié)構(gòu)和孔隙率及優(yōu)異的生物相容性［5～8］.

海藻酸鈉（SA）為陰離子型天然高分子多糖，易溶于水［9］，在室溫下，將二價(jià)陽離子（如Ca2+）添加入SA水溶液中，會(huì)形成穩(wěn)定的凝膠［10］；另外，SA還具有良好的生物相容性、可生物降解性及親水性，因此在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如被用于藥物及生長因子的遞送、細(xì)胞包封及組織工程等［11，12］. 殼聚糖（CS）作為幾丁質(zhì)的脫乙?；苌铮顷栯x子性質(zhì)的天然多糖［13］. 其多糖結(jié)構(gòu)與骨和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的葡萄氨基葡聚糖結(jié)構(gòu)具有相似性，可以加速細(xì)胞的分化和成熟［14］；并且CS還具有加速傷口愈合、抗菌和促進(jìn)骨骼再生的作用，因此被用于骨組織工程［15，16］. 但CS 和SA 強(qiáng)度不足及降解速率過快等缺陷限制了其發(fā)展.

氧化石墨烯（GO）是石墨烯的衍生物，具有高比表面積及高機(jī)械性能等優(yōu)點(diǎn). 其基本結(jié)構(gòu)是二維單層碳原子結(jié)構(gòu)，表面含有大量羥基、羧基及環(huán)氧基等含氧官能團(tuán)［17］，這些基團(tuán)的存在賦予了GO通過靜電相互作用、氫鍵、π-π共軛作用與生物活性分子或其它材料結(jié)合構(gòu)建復(fù)合支架材料的可能性，進(jìn)而提高復(fù)合支架材料的生物相容性及機(jī)械性能［18，19］. Purohit 等［20］將GO加入到海藻酸鈉-明膠支架中，不僅增加了支架的機(jī)械性能，同時(shí)檢測(cè)到細(xì)胞的黏附和增殖得到明顯的改善，使得GO在骨組織工程領(lǐng)域被廣泛研究.

目前，關(guān)于將GO與生物相容性好的SA和CS復(fù)合的研究報(bào)道仍較少. 本文利用冷凍干燥技術(shù)將不同量的GO與SA和CS復(fù)合，研究了GO的含量對(duì)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0，0.3%，0.5%，0.7%，1%）支架材料理化性能的影響，并得出最佳GO含量，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

海藻酸鈉，黏度為4～12 mPa?s，美國Sigma 公司；殼聚糖，脫乙酰度為80.0%～95.0%，黏度為50～800 mPa?s，國藥化學(xué)集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氧化石墨烯，南京先豐納米材料有限公司；無水氯化鈣（CaCl2）、冰醋酸和溴化鉀（KBr），分析純，北京化工廠；磷酸鹽緩沖溶液（PBS），美國Hyclone 公司；C6005型CCK-8試劑，新賽美生物科技公司.

Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜（FTIR）儀，美國Thermo公司；酶標(biāo)儀，美國Bio-TEK公司；AGXplus系列臺(tái)式電子萬能試驗(yàn)機(jī)，日本Shimadzu公司；JE0L-6700F型掃描電子顯微鏡（SEM），日本電子公司；ALPHA1-2LD型冷凍干燥機(jī)，德國Marin Christ公司；AL204型電子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；SPX-150BE型恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 支架的制備 在攪拌條件下，將2 g SA粉末分次溶于100 mL去離子水中，以1000 r/min的速率攪拌2 h，得到SA儲(chǔ)備溶液，置于4 ℃冰箱備用.

在攪拌條件下，將2 g CS粉末分次溶于100 mL 0.5 mol/L的冰醋酸水溶液中，以1000 r/min的速率攪拌2 h，得到CS儲(chǔ)備溶液，置于4 ℃冰箱備用.

在攪拌條件下，將0.1 g GO 粉末溶于100 mL去離子水中，以500 r/min 的速率攪拌1 h后，超聲振蕩分散2 h，置于4 ℃冰箱備用.

按照m（SA）∶m（CS）=1∶1 的比例，在攪拌條件下，用注射器分次抽取SA 溶液緩慢滴加到CS 溶液中，以1000 r/min速率于室溫下連續(xù)攪拌4 h，置于4 ℃冰箱中備用.

將一定體積的GO 溶液加入到SA-CS 混合溶液中，以1000 r/min 的速率攪拌24 h，分別制備出GO含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為0，0.3%，0.5%，0.7%，1%的混合溶液，恒溫下高速攪拌12 h.

將上述混合溶液放入24孔板，于?20 ℃下冷凍24 h，再于?80 ℃冷凍干燥. 將冷凍干燥后的支架在20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的CaCl2溶液中浸泡1 h，然后用20 mL去離子水沖洗3次，再次冷凍干燥. 以制得的SA-CS 支架作為空白組，GO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.3%，0.5%，0.7%，1%的GO-SA-CS 支架作為實(shí)驗(yàn)組，樣品分別標(biāo)記為0.3GO，0.5GO，0.7GO和1GO.

1.2.2 溶脹比的測(cè)定 將各組支架稱重，記為m0，然后充分浸入等量去離子水中，2 h后取出，用濾紙輕輕吸干支架表面水分，再次稱重，記為m1. 每組樣品做3 個(gè)平行樣，利用下式計(jì)算溶脹率（Swelling ratio，%）：

1.2.3 孔隙率的測(cè)定 將裝滿無水乙醇的比重瓶稱重，記為m′，將稱重為m0的干燥支架放入比重瓶內(nèi)，超聲振蕩，無明顯氣泡后再次加滿無水乙醇，稱重，記為m2；將浸有無水乙醇的支架取出，稱重比重瓶和剩余無水乙醇的重量，記為m3；每組樣品做3 個(gè)平行樣，根據(jù)下式計(jì)算支架孔隙率（Porosity ratio，%）：

1.2.4 支架體外降解檢測(cè) 將各組支架稱重，記為m0，分別置于等量PBS溶液中完全浸泡，于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于3，6，9，12，15，18，21 d后取出，用等量去離子水反復(fù)沖洗3次，再次冷凍干燥，稱重，記為m4. 每組做3個(gè)平行樣，通過下式計(jì)算支架的質(zhì)量損失分?jǐn)?shù)（Mass loss，%）：

1.2.5 力學(xué)性能的測(cè)定 將各組支架制備成直徑10 mm、高10 mm的圓柱體，在測(cè)試溫度為23 ℃，恒應(yīng)變速度為0.60 mm/min條件下，利用電子萬能試驗(yàn)機(jī)測(cè)試支架的彈性模量.

1.2.6 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將各組支架消毒滅菌處理后，置于24 孔板中，各加入2 mL 完全細(xì)胞培養(yǎng)液［DMEM 培養(yǎng)基，含胎牛血清10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），鏈霉素100 μg/mL，青霉素100 U/mL］，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培育箱中孵育24 h 后，吸取浸提液分別用細(xì)菌濾器過濾，制得用于細(xì)胞培養(yǎng)的支架浸提液.

小鼠前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）由吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，調(diào)整細(xì)胞（第三代）密度為5×103Cell/孔，接種到96孔板中，用倒置顯微鏡觀察孔板底部細(xì)胞密度>90%時(shí)，吸棄原培養(yǎng)基，用完全細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗2次后更換各組支架浸提液100 μL/孔，實(shí)驗(yàn)分為3組：實(shí)驗(yàn)組（各組支架浸提液接種細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞）和空白組（單純細(xì)胞培養(yǎng)基，無細(xì)胞），每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，在培養(yǎng)24，48，72 h后取出. 吸棄原培養(yǎng)基，用完全細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗1次，按照CCK-8試劑盒操作說明，向每孔加入10 μL CCK-8溶液及100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)放入細(xì)胞孵育箱培育2 h后取出，利用酶標(biāo)儀在波長450 nm條件下讀取吸光度值（OD），通過下式計(jì)算細(xì)胞存活率，并根據(jù)根據(jù)國家體外細(xì)胞毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T16886.5-2003，如表1示，0級(jí)和1級(jí)代表支架材料無明顯細(xì)胞毒性，2～4級(jí)代表支架材料細(xì)胞毒性依次增加）對(duì)各組支架細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)級(jí)：

式中，下角標(biāo)exp.，blank和nc分別代表實(shí)驗(yàn)組、空白組和陰性對(duì)照組.

Table 1 Toxicity classification criteria and toxicity evaluation results

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖1 為各組支架的傅里葉變換紅外光譜圖. 在SA 的譜線中，3427 cm?1附近的寬峰歸屬為—OH伸縮振動(dòng)峰，1606 cm?1處為C=O 特征峰［21］；在CS 的譜線中，3650～3000 cm?1范圍內(nèi)的吸收帶歸屬為—OH的伸縮振動(dòng)，3427 cm?1附近較寬的吸收峰歸屬為—OH 伸縮振動(dòng)吸收峰與—NH 的伸縮振動(dòng)吸收峰重疊而增寬的多重吸收峰，1649 和1595 cm?1處分別為酰胺Ⅰ中C=O 的伸縮振動(dòng)吸收峰和酰胺Ⅱ中的N—H的彎曲振動(dòng)吸收峰；在SA-CS的譜線中，1649 和1595 cm?1處的收峰移動(dòng)到1619 cm?1處，說明SA和CS通過靜電作用相互結(jié)合，且光譜中3448 cm?1處的特征峰歸屬為—OH 的伸縮振動(dòng)；在0.3GO，0.5GO，0.7GO 和1GO 支架的譜線中，—OH 的特征峰分別出現(xiàn)在3439，3430，3423和3417 cm?1處，與SA-AC 相比，峰位向低波數(shù)移動(dòng). 氫鍵可使基團(tuán)化學(xué)鍵力常數(shù)減小，導(dǎo)致分子躍遷振動(dòng)所需的能量變小，在紅外光譜圖上表現(xiàn)為伸縮振動(dòng)波數(shù)降低. 而GO 表面富含的—OH，—COOH 和—C=O 含氧基團(tuán)可與CS 中的—NH2，—OH 及SA 所含的—OH 和—COOH 之間形成氫鍵，因此導(dǎo)致—OH的伸縮振動(dòng)特征峰紅移.

Fig.1 FTIR spectra of SA(a), CS(b), SA?CS(c),0.3GO(d),0.5GO(e),0.7GO(f)and 1GO(g)

2.2 支架的宏觀外形及微觀結(jié)構(gòu)

圖2為支架材料的宏觀圖片. 可見，支架材料在室溫下呈固態(tài)海綿狀，SA-CS組支架呈白色，加入GO后顏色加深；具有一定的可塑性，與冷凍干燥過程中所用容器形狀相符（以24孔板為例），因此可根據(jù)需要制備成與所用容器相符的形狀.

Fig.2 Photographs of SA?CS(A),0.3GO(B),0.5GO(C),0.7GO(D)and 1GO(E)

圖3 為各組支架的SEM 照片. 可見，支架內(nèi)部均為三維網(wǎng)狀互通結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可為細(xì)胞的黏附、增殖、分化進(jìn)而形成新生骨基質(zhì)提供空間［22］；隨著GO 的加入及含量的增加，支架內(nèi)部的孔徑逐漸減小，結(jié)構(gòu)也更加致密. 通過Nano Measure 軟件分析每組支架的平均孔徑大小，算得支架SA-CS，0.3GO，0.5GO，0.7GO 和1GO 的孔徑依次為（217.14±19.74），（163.73±17.65），（162.48±24.39），（160.43±1.12）和（151.89±8.41）μm，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. 已有研究表明，孔隙是由支架內(nèi)部冰晶在冷凍干燥過程中升華而形成的，而孔隙的尺寸由冰晶大小決定［23］. 加入的GO可以與SA和CS形成交聯(lián)，GO含量越高，交聯(lián)越充分，支架結(jié)構(gòu)也更加緊密，故限制了水分子的自由進(jìn)入，使冰晶形成受阻，孔徑尺寸也隨之降低. 由圖4可見，隨著GO的加入和含量的增加，支架的孔壁厚度增加，SA-CS 支架的孔壁厚度約為0.134 μm，而當(dāng)GO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，支架的孔壁厚度高達(dá)0.691 μm. 支架內(nèi)部孔壁的厚度與支架的機(jī)械性能是密切相關(guān)的，在植入骨缺損區(qū)后可防止結(jié)構(gòu)的坍塌.

Fig.3 SEM images of SA?CS(A),0.3GO(B),0.5GO(C),0.7GO(D)and 1GO(E)

Fig.4 SEM images showing the wall thickness of SA?CS(A), 0.3GO(B), 0.5GO(C),0.7GO(D)and 1GO(E)

2.3 支架的溶脹比

溶脹比是衡量支架材料親水性的一個(gè)重要指征，適宜的溶脹比有利于營養(yǎng)物質(zhì)的輸送. 圖5示出了各組支架的溶脹比結(jié)果：SA-CS 組溶脹比最高，達(dá)到（1200.81±48.63）%；隨著支架中GO 含量的增加，溶脹比逐漸減小，0.3GO，0.5GO，0.7GO 和1GO 的溶脹比分別為（1067.38±8.27）%，（1051.30±10.16）%，（953.61±40.15）%，（939.73±21.85）%，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. 原因可能是：隨著GO含量增加，其與CS和SA形成更充分的物理交聯(lián)，反應(yīng)更加完全；同時(shí)引入后的GO也作為一種納米增強(qiáng)相，使復(fù)合支架的結(jié)構(gòu)更加致密，阻止了水分子的進(jìn)入，溶脹能力因此隨之下降.但對(duì)于骨組織工程支架，過高的溶脹比意味著過量的水分進(jìn)入支架內(nèi)部，不僅會(huì)對(duì)支架產(chǎn)生由內(nèi)向外的壓力，使其孔徑增大，結(jié)構(gòu)崩塌，機(jī)械強(qiáng)度降低，降解速率加快，還會(huì)對(duì)初期黏附于支架表面的細(xì)胞產(chǎn)生“沖刷”作用，造成黏附細(xì)胞的脫落，進(jìn)而影響骨組織的新生［24］. 所以，GO的加入在適當(dāng)降低支架溶脹比的情況下又保存了支架的親水性，仍然使支架材料具有保存體液及向細(xì)胞運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)的作用.

Fig.5 Swelling ratios of the scaffolds

Fig.6 Porosities of the scaffolds

2.4 支架的孔隙率

適宜的孔隙率是促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞遷移、生長及代謝產(chǎn)物排泄的前提［25］. 如圖6所示，GO的加入及含量的增加對(duì)支架孔隙率無明顯影響，SA-CS支架組孔隙率為（84.40±3.70）%，隨著GO的加入及含量增加，孔隙率逐漸下降，分別為（78.40±1.84）%，（77.43±1.72）%，（76.59±1.96）%，（73.76±1.72）%，組間比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）.

2.5 支架的體外降解

理想的骨支架材料的降解速率應(yīng)與骨組織的新生速率相匹配，給予組織新生充足的時(shí)間和空間［26］. 由圖7 可見，各組支架體外降解曲線均呈線性，體外降解第21 d，對(duì)照組支架的降解率高達(dá)64.41%，而實(shí)驗(yàn)組支架隨GO 含量增加降解率依次為47.90%，41.56%，38.54%和36.19%. 說明GO的加入在很大程度上降低了復(fù)合支架的降解速率，且GO 的含量越高，支架的降解速率越慢. 這是由于GO 的加入以及含量的增加限制了過量水分子的進(jìn)入，進(jìn)而延緩了支架的降解速率.

2.6 支架的機(jī)械性能

優(yōu)異的機(jī)械性能對(duì)骨組織工程支架材料至關(guān)重要，是其承受周圍應(yīng)力和起支撐作用的保障. 而機(jī)械強(qiáng)度又與分子鍵的結(jié)合強(qiáng)度、鍵合方式、化學(xué)成分、支架微觀結(jié)構(gòu)及孔隙率有關(guān)，是一個(gè)綜合的考量.

圖8示出了各組支架的機(jī)械性能. SA-CS支架彈性模量為（1.27±0.01）MPa；當(dāng)GO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%和0.5%時(shí)，彈性模量分別增加到（1.39±0.04）和（1.62±0.02）MPa，而當(dāng)GO 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到0.7%和1%時(shí)，彈性模量又進(jìn)一步增加，分別為（1.81±0.02）和（1.97±0.02）MPa. 這可能歸因于GO表面的含氧官能團(tuán)與SA和CS之間形成的化學(xué)鍵，隨著GO濃度的增加，分子量的增加和分子間作用力的增強(qiáng)使得支架更加緊密，機(jī)械性能也隨之增強(qiáng)［27］；同時(shí)，結(jié)合SEM觀察結(jié)果，GO的加入會(huì)使支架孔壁厚度增加，也會(huì)使得支架機(jī)械強(qiáng)度增大.

Fig.7 Plots of mass loss of scaffolds

Fig.8 Elastic modulus of the scaffolds

Fig.9 In vitro cytotoxicity of the scaffold

2.7 支架的體外細(xì)胞毒性

支架材料植入體內(nèi)的首要前提是具有良好的生物相容性，不產(chǎn)生細(xì)胞毒性. 圖9示出了不同GO含量支架的體外細(xì)胞毒性結(jié)果. 在培養(yǎng)24，48 和72 h 后，對(duì)照組細(xì)胞存活率都大于90%，說明SA 和CS具有良好的生物相容性；而當(dāng)支架中加入GO之后，細(xì)胞存活率表現(xiàn)出對(duì)GO含量的依賴性，培養(yǎng)72 h后，當(dāng)GO含量為0.3%時(shí)，細(xì)胞存活率為129%，明顯高于對(duì)照組，而當(dāng)GO濃度升高至0.5%，0.7%和1%時(shí)，細(xì)胞存活率卻分別衰減到65%，63%和50%；這可能是由于GO表面富含的含氧官能團(tuán)賦予其親水性，所以適宜含量的GO可以對(duì)細(xì)胞的生長起到一定的促進(jìn)作用；但高含量的GO卻會(huì)引起高強(qiáng)度的氧化應(yīng)激，干擾細(xì)胞代謝，同時(shí)氧化區(qū)域破壞細(xì)胞膜磷脂，進(jìn)而造成細(xì)胞死亡［28］.

在培養(yǎng)72 h之后，隨著GO的含量的遞增，支架的細(xì)胞毒性等級(jí)依次為0，0，2，2和2. 說明當(dāng)支架中GO含量為0.3%時(shí)，細(xì)胞存活率率達(dá)到最優(yōu)，支架材料具有最佳的生物相容性.

3 結(jié) 論

理想的骨支架材料首先在物理性能上應(yīng)具有合適的孔徑和孔隙率、適宜的溶脹比、出色的機(jī)械性能和可控的降解速率;其次,在生物性能上要有優(yōu)異的生物相容性;前者是基礎(chǔ),后者為關(guān)鍵.本實(shí)驗(yàn)利用冷凍干燥技術(shù)制備了含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氧化石墨烯?海藻酸鈉?殼聚糖復(fù)合支架材料.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與海藻酸鈉?殼聚糖空白組支架相比,氧化石墨烯加入后的復(fù)合支架材料在溶脹比、降解速率和機(jī)械性能方面均展現(xiàn)一定的優(yōu)勢(shì),且該優(yōu)勢(shì)隨著氧化石墨烯含量的升高愈加顯著;但體外細(xì)胞毒性結(jié)果顯示,當(dāng)氧化石墨烯質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高時(shí),細(xì)胞毒性卻逐漸增加,造成細(xì)胞數(shù)目逐漸減少,當(dāng)氧化石墨烯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí),細(xì)胞存活率高于空白組,達(dá)129%.綜合支架物理及生物學(xué)性能結(jié)果,當(dāng)氧化石墨烯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)支架材料性能達(dá)到最優(yōu),符合骨組織工程支架材料的基本要求.本文研究結(jié)果表明,以氧化石墨烯?海藻酸鈉?殼聚糖為原料構(gòu)建的復(fù)合支架可以在保留支架良好生物學(xué)性能的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改善支架的機(jī)械性能,為GO在骨組織工程材料中的應(yīng)用和開發(fā)中提供了新思路.