張愛芹，王 嫚，申剛義，金 軍

（1.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,2.中央民族大學(xué)藥學(xué)院,北京100081）

多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）類溴代阻燃劑由于蒸汽壓低、親脂性強(qiáng)，能通過遠(yuǎn)距離遷移和生物蓄積進(jìn)入人體產(chǎn)生多種毒副作用及致癌性，已成為威脅生態(tài)環(huán)境和人類健康的全球性環(huán)境污染物［1～3］. PBDEs主要通過皮膚接觸、呼吸、飲水和食物等多種途徑進(jìn)入生物體并產(chǎn)生對(duì)疾病相關(guān)通路的干擾，是其產(chǎn)生健康危害的起點(diǎn)［4］. 目前，對(duì)PBDEs與受體蛋白以及遺傳物質(zhì)等生物分子的交互作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍不足，難以揭示其在生物體內(nèi)導(dǎo)致毒性效應(yīng)并與特定疾病表型相關(guān)聯(lián)的途徑及機(jī)制. 探明PBDEs在體內(nèi)暴露水平、分布及其對(duì)毒性作用通路的擾動(dòng)機(jī)制已成為探索環(huán)境暴露與健康危害因果聯(lián)系的關(guān)鍵問題.

人血清白蛋白（HSA）作為血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，是污染物在人體血液中的主要轉(zhuǎn)運(yùn)媒介［5］. 污染物進(jìn)入人體后與HSA 形成復(fù)合物，繼而被轉(zhuǎn)運(yùn)到受體部位或靶器官而產(chǎn)生生理毒理作用.研究PBDEs 與HSA的相互作用對(duì)深入了解污染物的致毒機(jī)制具有重要意義［6，7］. 研究者們利用光譜和計(jì)算機(jī)模擬對(duì)PBDEs與HSA相互作用的熱力學(xué)機(jī)制進(jìn)行了研究［8～11］. 然而，在對(duì)于揭示污染物體內(nèi)蓄積、分布、代謝等過程中起關(guān)鍵作用的污染物-蛋白相互作用的動(dòng)力學(xué)速率、強(qiáng)弱等機(jī)制方面尚未明確，系統(tǒng)探究不同取代基個(gè)數(shù)和位置的PBDEs與HSA相互作用的差異及規(guī)律，對(duì)從分子結(jié)構(gòu)層次理解PBDEs的毒理學(xué)機(jī)制具有重要意義.

表面等離子體共振技術(shù)（SPR）是一種免標(biāo)記型光學(xué)生物傳感方法，在研究生物分子相互作用方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［12］. 其具有微量化、高靈敏、通用性好及實(shí)時(shí)快速等優(yōu)點(diǎn)，還可同時(shí)獲得相互作用過程的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)信息，便于在模擬生理?xiàng)l件下探究分子相互作用的整個(gè)過程［13，14］. 本文以HSA為受體模型，以8 種典型PBDEs 同族體（BDE28，BDE47，BDE99，BDE100，BDE153，BDE154，BDE183，BDE209）為分析對(duì)象，利用SPR技術(shù)在模擬生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究了它們之間的相互作用；結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助分子對(duì)接模擬，從理論角度探討了兩者的相互作用機(jī)制，并與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互驗(yàn)證. 基于HSA建立的研究方法和模型，將適用于PBDEs與脂蛋白或受體蛋白相互作用的研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

GLH傳感芯片和偶聯(lián)試劑盒［N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS）、N-乙基-N′-（二甲氨基丙基）碳二亞胺（EDC）和1.0 mol/L 鹽酸乙醇胺（pH=8.5）均為分析純］購(gòu)自美國(guó)BioRad 公司；HSA（純度≥96.0%）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；8 種PBDEs 標(biāo)準(zhǔn)品（BDE28，BDE47，BDE99，BDE100，BDE153，BDE154，BDE183，BDE209）購(gòu)自美國(guó)Accustandard 公司；二甲基亞砜（DMSO）、吐溫20、Na3PO4、NaCl、HCl和醋酸均為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司.

ProtenOn XPR36生物分子相互作用系統(tǒng)（美國(guó)BioRad公司）；PB-10 型pH計(jì)（德國(guó)Sartorius公司）；XP205型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；Mini離心機(jī)（北京昊諾斯公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 樣品的配制 固定蛋白運(yùn)行緩沖液（PBST）為含150 mmol/L NaCl 和0.005%（體積分?jǐn)?shù)）吐溫20的10 mmol/L Na3PO4溶液（pH=7.4）；相互作用運(yùn)行緩沖液（PBSTD）為含5%（體積分?jǐn)?shù)）DMSO的PBST.

將各分析物溶于DMSO中形成母液，用PBSTD稀釋至20 μmol/L（BDE-209為100 μmol/L），再依次按3倍倍比稀釋4次得5組濃度梯度（0.25，0.74，2.22，6.67，20 μmol/L），另設(shè)一個(gè)PBSTD作空白對(duì)照，組成6組梯度濃度. 所有溶液使用前均經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾.

1.2.2 HSA芯片的固定 蛋白固定采用氨基偶聯(lián)法：25 ℃下，將0.1 mol/L Sulfo-NHS和0.4 mol/L EDC 1∶1（體積比）混合并流過芯片通道，流速25 μL/min，時(shí)間360 s；將0.68 mg/mL 的HSA 醋酸緩沖溶液（pH=4.5）以相同流速流過芯片通道，與芯片上活化的羧基反應(yīng)，時(shí)間360 s；鹽酸乙醇胺以相同流速流過芯片通道，時(shí)間360 s；通入PBST去除非特異性吸附. 同時(shí)設(shè)置第2個(gè)通道作為對(duì)照通道（只活化封閉而不固定蛋白）.

1.2.3 PBDEs與HSA相互作用的動(dòng)態(tài)測(cè)試 在25 ℃下，同一分析物的6組梯度濃度以25 μL/min流速垂直流過固定蛋白通道并與HSA作用，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)采集信號(hào). 相互作用的結(jié)合時(shí)間為240 s，解離360 s.

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用雙參比和體積排除法，扣除空白通道和空白溶液的背景信號(hào)和溶劑效應(yīng). 利用ProtenOn Manager 2.1.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理.

1.2.5 PBDEs 與HSA 的分子對(duì)接模擬 采用AutoDock［15，16］對(duì)PBDEs 與HSA 的對(duì)接進(jìn)行模擬，采用AutoDockTools［17］和PyMOL［18，19］進(jìn) 行 對(duì) 接 結(jié) 果 展 示 和 分 析. HSA 晶 體 結(jié) 構(gòu)（PDB ID：1AO6）取 自Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)［20］，PBDEs取自小分子數(shù)據(jù)庫(kù)［21］. 每種PBDE與HSA隨機(jī)100次分子對(duì)接，對(duì)能量的優(yōu)化采用拉馬克遺傳算法（LGA），選取得分權(quán)重最高構(gòu)象作為最終對(duì)接結(jié)果. 通過結(jié)合自由能（ΔG）對(duì)PBDEs與HSA的作用進(jìn)行評(píng)價(jià).

2 結(jié)果與討論

2.1 PBDEs與HSA相互作用的動(dòng)力學(xué)分析

將HSA作為受體，其固定量大小對(duì)相互作用有直接影響. 圖1給出了HSA在芯片表面實(shí)時(shí)固定的動(dòng)態(tài)過程，其結(jié)合速率很快，50 s內(nèi)即達(dá)到平衡，最終標(biāo)記量為22000 RU（22 kRU），表明HSA在芯片表面的固定量約為22 ng/mm2［22］，適合與小分子相互作用研究.

圖2為8種PBDEs與HSA實(shí)時(shí)相互作用的動(dòng)力學(xué)傳感圖，示出了結(jié)合和解離的整個(gè)動(dòng)態(tài)過程. 在結(jié)合起始階段，分析物濃度越高則復(fù)合物越多，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)響應(yīng)值不再增加. 而在解離階段，復(fù)合物分解同時(shí)響應(yīng)值降低，復(fù)合物濃度越高解離越多.

依據(jù)Langmuir模型，分析物與HSA的作用遵循準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)：

Fig.1 Immobilization of HSA on the surface of a sensor chip at 25 ℃

Fig.2 Real?time sensorgrams of kinetic analysis of the interactions between PBDEs and HSA at 25 ℃

式中：A為分析物；B為芯片上固定的HSA；A-B為芯片上生成的復(fù)合物；ka（L·mol?1·s?1）為結(jié)合速率常數(shù)；kd（s?1）為解離速率常數(shù).

結(jié)合階段動(dòng)力學(xué)方程為

式中：［A-B］（mol/L）為反應(yīng)時(shí)間t（s）時(shí)芯片上復(fù)合物的濃度，對(duì)應(yīng)于t時(shí)的響應(yīng)值；［A］（mol/L）為分析物濃度；［B］（mol/L）為反應(yīng)時(shí)間t時(shí)芯片表面未被結(jié)合蛋白的濃度，定義如下：

式中：［A-B］max為芯片上A與B結(jié)合達(dá)到飽和時(shí)復(fù)合物的濃度，對(duì)應(yīng)最大響應(yīng)值Rmax.

將式（3）帶入式（2）得：

對(duì)動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行平滑擬合（圖2平滑曲線）并結(jié)合上述公式，可計(jì)算相互作用過程的各動(dòng)力學(xué)參數(shù)（見表1）.ka和kd反映了分析物與HSA 相互作用動(dòng)力學(xué)結(jié)合和解離速率的快慢.KD可反映結(jié)合力或親和力的大小，KD越小親和力越大.

通過比較可見，BDE209與HSA相互作用的動(dòng)力學(xué)過程［圖2（H）］與其它PBDEs 有明顯差異. 在結(jié)合階段，ka（0.30×103）明顯小于其它化合物，生成的復(fù)合物量較少. 解離階段kd（0.98×10?2）也明顯減慢，復(fù)合物較難解離，解離時(shí)間結(jié)束時(shí)（360 s）尚未完全解離.受動(dòng)力學(xué)結(jié)合速率和解離速率共同影響，其親和力明顯小于除BDE28外的其它6種（表1）.

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PBDEs中溴原子個(gè)數(shù)及取代位置的差異對(duì)相互作用有規(guī)律性的影響. 首先，隨溴原子個(gè)數(shù)增加（從BDE28，BDE47，BDE 99，BDE 153 到BDE 183，依次為三溴至七溴）相互作用的解離速率逐漸減慢，親和力依次增大. 表明溴原子個(gè)數(shù)增加有利于PBDEs 與HSA 的相互作用. 基于動(dòng)力學(xué)分析，顯示可能與溴原子個(gè)數(shù)增加減緩了復(fù)合物的解離速率有關(guān).

其次，對(duì)溴原子不同取代位置的同分異構(gòu)體比較發(fā)現(xiàn)，間位溴的BDE99與HSA的ka（5.77×103）明顯大于鄰位溴的BDE100（ka=1.14×103）. 前者達(dá)到結(jié)合平衡所需時(shí)間［圖2（C），約30 s］遠(yuǎn)快于后者［圖2（D），約100 s］. 在解離階段，BDE99的kd（3.92×10?2）大于BDE100（kd=1.76×10?2）. 由于結(jié)合速率差異更大，BDE99 與HSA 的親和力（KD=0.68×10?5）大于BDE100（KD=1.54×10?5）的. 同樣，PBDE153（間位溴）與HSA的親和力也大于BDE154（鄰位溴）的. 表明在PBDEs的同分異構(gòu)體中，間位溴比鄰位溴利于PBDEs與HSA的相互作用. 動(dòng)力學(xué)分析顯示這種差異可能源自結(jié)合速率快慢的影響.

2.2 PBDEs與HSA相互作用的穩(wěn)態(tài)分析

穩(wěn)態(tài)為結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)的狀態(tài)，可根據(jù)反應(yīng)平衡分析PBDEs與HSA相互作用的親和力.

根據(jù)式（1），穩(wěn)態(tài)時(shí)復(fù)合物形成與解離的速率相等：

其中，［A］eq和［B］eq分別為平衡時(shí)分析物濃度和芯片表面未被結(jié)合的蛋白濃度；［A-B］eq為平衡時(shí)復(fù)合物的濃度，對(duì)應(yīng)平衡時(shí)的響應(yīng)值.

將式（7）代入式（5）可得：

Table 1 Kinetic parameters of interactions between PBDEs and HSA

由于［B］eq=［A-B］max?［A-B］eq，代入式（8）可得：

當(dāng)［A］eq=KD時(shí)：

即KD等于最大復(fù)合物濃度一半對(duì)應(yīng)的分析物濃度，等同米氏常數(shù)KM. 將每種分析物的6個(gè)濃度梯度與平衡時(shí)的響應(yīng)值作圖，擬合后計(jì)算結(jié)果列于表2. 其中，Rmax為最大響應(yīng)值，Chi2為評(píng)估曲線擬合的卡方值. 可見，穩(wěn)態(tài)分析的親和力數(shù)據(jù)和動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)（表1）基本一致（線性相關(guān)系數(shù)R2=0.945），驗(yàn)證了該方法的可靠性.

Table 2 Affinity parameters of interactions between PBDEs and HSA based on the steady state analysis

2.3 PBDEs與HSA分子對(duì)接模擬

利用分子對(duì)接技術(shù)從微觀角度分析了PBDEs 與HSA 的作用模式和結(jié)合位點(diǎn). 外源性物質(zhì)與HSA的結(jié)合位點(diǎn)主要位于Site I（IIA）和Site II（IIIA）［23，24］. 分子對(duì)接結(jié)果顯示，8 種PBDEs 均結(jié)合于HSA 的Site I處，與文獻(xiàn)［25］報(bào)道一致，并且它們主要位于由Leu，Trp，Ile，Phe，Val和Tyr等多種疏水性氨基酸殘基構(gòu)成的疏水空腔內(nèi). 圖3 顯示了3 種PBDEs（BDE28，BDE154 和BDE183）與HSA 的分子對(duì)接三維圖. 可見，PBDEs雖然都位于Site I處，但它們的最佳構(gòu)象不同，其在空腔中存在不同的平動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)等方式，空腔功能區(qū)周邊的氨基酸活性位點(diǎn)存在差異，因此分子間疏水力、范德華力、氫鍵以及靜電力等相互作用力不同，綜合導(dǎo)致它們與HSA結(jié)合力不同.

Fig.3 3D molecular docking images of BDE28(A),BDE154(B),BDE183(C)and HSA at 25 ℃

進(jìn)一步分析了8種PBDEs與HSA分子對(duì)接最佳構(gòu)象的各種熱力學(xué)參數(shù)（表3），發(fā)現(xiàn)范德華力和氫鍵作用力對(duì)結(jié)合能的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于靜電力. 比較可發(fā)現(xiàn)，PBDEs結(jié)構(gòu)中溴原子的個(gè)數(shù)及取代位置的差異會(huì)使其與HSA的結(jié)合能有明顯差異. 除BDE209外，范德華力和氫鍵作用力及結(jié)合能均隨溴原子的增加依次增強(qiáng)，與實(shí)驗(yàn)親和力（表1）和文獻(xiàn)［11］趨勢(shì)相同，這可能是由于溴原子的引入能促進(jìn)分子間作用力增強(qiáng). 而對(duì)于同分異構(gòu)體，間位溴取代的BDE99比鄰位溴取代的BDE100具有更大的范德華力和氫鍵作用力，同時(shí)靜電引力也要略大于鄰位，從而使間位溴取代的BDE99 與HSA 的結(jié)合能（?ΔG=33.23 kJ/mol）大于鄰位溴的BDE100（?ΔG=32.14 kJ/mol）. 類似地，間位溴BDE153（?ΔG=35.53 kJ/mol）也大于鄰位溴BDE154（?ΔG=34.40 kJ/mol）. 與實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)相同. 這可能是位于醚鍵的鄰位溴取代相比于間位溴取代增強(qiáng)了分子的剛性而降低了其柔性，產(chǎn)生了更大的位阻效應(yīng)，限制了其結(jié)合的最佳結(jié)合構(gòu)象，從而使其與周邊氨基酸殘基作用力減弱. 而對(duì)于BDE209，雖然溴原子的增加有利于與HSA結(jié)合，但其分子中圍繞著醚鍵共有4個(gè)鄰位溴，剛性大柔性小，空間位阻顯著增大，大大阻礙了與HSA的結(jié)合，致使親和力變小. 而BDE209與HSA的親和力大于BDE28可能是溴原子個(gè)數(shù)和取代位置綜合作用的結(jié)果. 分子對(duì)接結(jié)果與利用SPR測(cè)定PBDEs與HSA相互作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致.

Table 3 Theoretical and experimental thermodynamic parameters of the interactions between PBDEs and HSA

根據(jù)?RTlnKA=ΔG和KA=1/KD，可得實(shí)驗(yàn)中PBDEs和HSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)吉布斯自由能ΔG.從表3 可見，無(wú)論是實(shí)驗(yàn)還是理論計(jì)算結(jié)果，各PBDEs 和HSA 相互作用的ΔG均小于0，表明它們與HSA的反應(yīng)可自發(fā)進(jìn)行. 實(shí)驗(yàn)ΔG值小于理論值，數(shù)據(jù)間有較好的相關(guān)性（R2=0.784），顯示兩種方法具有較好的一致性.

3 結(jié) 論

采用SPR和分子對(duì)接技術(shù)分析了8種PBDEs與HSA 的相互作用. 利用SPR技術(shù)不僅可通過動(dòng)態(tài)曲線直觀揭示不同PBDEs與HSA的相互作用，還可獲得相互作用過程的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PBDEs中溴原子的個(gè)數(shù)和取代位置對(duì)PBDEs與HSA作用有規(guī)律性的影響. 動(dòng)力學(xué)分析顯示同分異構(gòu)體結(jié)合力的差異可能主要源自結(jié)合速率的快慢. 分子對(duì)接結(jié)果顯示，8種PBDEs在HSA結(jié)合位點(diǎn)Site I處周邊功能區(qū)的氨基酸殘基類型存在差異. 范德華力和氫鍵在結(jié)合能的貢獻(xiàn)大于靜電力. 實(shí)驗(yàn)熱力學(xué)參數(shù)和計(jì)算模擬相互印證. 本研究基于HSA建立的方法同樣適用于PBDEs 與脂蛋白或受體蛋白等，為探索污染物與人體內(nèi)生物大分子蛋白的相互作用提供了技術(shù)途徑.