韓忠耀 宋偉 李燕 張濤 唐文雙 周福軍

摘 要 目的：研究黔產(chǎn)大接骨丹藥材不同用藥部位（根皮、樹皮、葉）中紫丁香苷和總黃酮含量的經(jīng)時變化特征，為該藥材的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。方法：分別以不同采收期（1-12月）大接骨丹藥材的根皮、樹皮和葉部位為樣品。采用高效液相色譜法測定其中紫丁香苷含量，色譜柱為Agela Promosil C18、流動相為0.5%磷酸溶液-乙腈（梯度洗脫）、流速為1.0 mL/min、檢測波長為210 nm、柱溫為35 ℃、進(jìn)樣量為5 μL。采用紫外-可見分光光度法測定其中總黃酮含量，檢測波長為510 nm。結(jié)果：紫丁香苷、總黃酮的質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.095 9～1.150 8 mg/mL（r=0.999 6）、0.072 2～1.083 0 mg/mL（r=0.999 9）;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于3%（n=6）;平均加樣回收率分別為101.74%（RSD=2.36%，n=6）、99.63%（RSD=2.19%，n=6）。不同采收期內(nèi)，大接骨丹藥材根皮、樹皮、葉中紫丁香苷含量分別在8、5、9月最高，總黃酮含量分別在2、12、9月最高。紫丁香苷含量在3個藥用部位的大小依次為樹皮>根皮>葉，其中樹皮部位中紫丁香苷含量普遍較高;總黃酮含量在3個藥用部位的大小依次為根皮>樹皮>葉，且3個用藥部位中總黃酮含量均普遍較低。根皮部位中總黃酮含量在當(dāng)年2月最高，且當(dāng)月根皮部位中紫丁香苷含量僅次于當(dāng)年8月;樹皮部位中紫丁香苷含量在5月最高，且當(dāng)月樹皮部位中總黃酮含量僅次于當(dāng)年10、12月;葉部位中總黃酮含量與紫丁香苷含量均在當(dāng)年9月最高。結(jié)論：建議大接骨丹藥材根皮部位在2月采收為宜，樹皮部位在5月采收為宜，葉部位在9月采收為宜。

關(guān)鍵詞 大接骨丹;藥用部位;高效液相色譜法;經(jīng)時變化;紫丁香苷;總黃酮

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study ongoing change characteristics of the contents of syringin and total flavonoids in different medicinal parts （root bark， tree bark， leaf） of Toricellia angulata from Guizhou， and to provide reference for the development and application of T. angulata. METHODS： The root bark， tree bark and leaf parts of T. angulata during different harvesting periods （Jan.-Dec.） were taken as the research samples. The content of syringin was determined by HPLC. The determination was performed on Agela Promosil C18 column with mobile phase consisted of 0.5% phosphoric acid solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set as 210 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 5 μL. The content of total flavonoids was determined by UV-visible spectrophotometry under detection wavelength of 510 nm. RESULTS： The linear range of syringin and total flavonoids were 0.095 9-1.150 8 mg/mL （r=0.999 6） and 0.072 2- 1.083 0 mg/mL （r=0.999 9）， respectively. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all less than 3% （n=6）. The average recoveries were 101.74% （RSD=2.36%， n=6） and 99.63% （RSD=2.19%， n=6）， respectively. During different harvesting periods， the contents of syringin in root bark， tree bark， leaf of T. angulata collected on Aug.， May and Sept. were the highest， and the contents of total flavonoids in samples collected on Feb.， Dec. and Sept. were the highest. The contents of syringin in different medicinal parts of T. angulata were in descending order as follows as tree bark>root bark>leaf， and the content of syringin was commonly relatively high in tree bark part; the content of total flavonoids in different medicinal parts of T. angulata were in descending order as follows as root bark>tree bark>leaf， and the contents of total flavonoids in three medicinal parts was generally low. The content of total flavonoids in root bark was the highest in Feb. of that year， and the content of syringin in root bark at same month was second only to Aug. of that year;the content of syringin in tree bark was the highest in May， and the content of total flavonoids in tree bark at same month was second only to Oct. and Dec. of that year;the contents of total flavonoids and syringin in leaf were the highest in Sept. of that year. CONCLUSIONS： It is suggested that Feb. is the best time for harvesting root bark， May for tree bark and Sept. for leaf of T. angulata.

KEYWORDS? ?Toricellia angulata; Medicinal part; HPLC; Ongoing change; Syringin; Total flavonoids

大接骨丹藥材來源于山茱萸科植物有齒鞘柄木[Toricellia angulata Oliv. var. intermedia （Harms） Hu]的根、根皮、樹皮及葉[1]，在貴州等地方標(biāo)準(zhǔn)中以根皮入藥[2-3]。大接骨丹中主要含有苯丙素苷類、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮苷類、二萜類等多種化學(xué)成分，已確定的單體化合物有紫丁香苷[4]、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、黃芪苷、β-谷甾醇、硬脂酸、軟脂酸、10-Griselinosidic acid等[5-7]，具有免疫調(diào)節(jié)等作用[8-9]。由于齒鞘柄木多在每年的3月中旬前后萌芽并在冬季落葉，故大接骨丹在貴州省少數(shù)民族聚集地和民族醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床施藥時，呈現(xiàn)春夏和初秋多以葉入藥，而冬季和早春多以根皮入藥的特點，并且有研究也發(fā)現(xiàn)大接骨丹樹皮具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛活性[10]，提示樹皮、葉這兩個部位也具有進(jìn)一步開發(fā)、利用的價值。

目前，關(guān)于大接骨丹藥材不同用藥部位藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究相對薄弱。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大接骨丹根皮、樹皮、葉這3個部位中成分差異較大，但均存在紫丁香苷和總黃酮這2種次生代謝產(chǎn)物。且據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，紫丁香苷具有抗腫瘤[11]、保護(hù)大鼠肝缺血再灌注損傷[12]、調(diào)節(jié)免疫、降糖、抗炎、抗氧化和抗肝毒性[13]等多種生物活性，總黃酮則具有抗氧化和抑菌[14]等生物活性，可作為大接骨丹中指標(biāo)性化學(xué)成分。此外，植物中次生代謝產(chǎn)物的動態(tài)積累規(guī)律可用于中藥材、民族藥品質(zhì)優(yōu)劣的評價[15]。鑒于此，本研究以紫丁香苷和總黃酮含量作為質(zhì)量控制與藥材品質(zhì)評價指標(biāo)，考察大接骨丹藥材3個用藥部位（根皮、樹皮、葉）中2種次生代謝產(chǎn)物（紫丁香苷、總黃酮）的含量差異，評價葉和樹皮部位可否作為根皮的潛在藥材替代資源，并研究這2種次生代謝產(chǎn)物的經(jīng)時變化特征，以確定不同用藥部位的最佳采摘時間，為該藥材的綜合開發(fā)利用、民間及民族醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀、Cary 100型紫外-可見分光光度計（美國Agilent公司）;FA1004B型萬分之一電子天平（溫州瑞昕儀器有限公司）;BT25S型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）;101-3AB型烘箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;WK-1000A型高速粉碎機(jī)（濰坊市北方制藥設(shè)備制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

大接骨丹藥材不同部位（根皮、樹皮、葉）采集自貴州省都勻市杉木湖溝渠，采集時間為2017年1-12月（本研究開展于2018年3-6月），每個自然月的15日各采集藥材樣本1次（采集信息見表1），樣品經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系韓忠耀副教授鑒定分別為山茱萸科植物有齒鞘柄木[T. angulata Oliv. var. intermedia （Harms） Hu]的根皮、樹皮和葉;紫丁香苷對照品（北京盛世康普化工技術(shù)研究院，批號：161214，純度：≥98%）;蘆丁對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-17122001，純度：≥98%）;乙腈（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純）;其余試劑均為分析純，水為純凈水（浙江娃哈哈集團(tuán)有限公司，批號：20180407）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品預(yù)處理

將采集的藥材樣品于烘箱55 ℃低溫烘干，打粉，過65目藥篩，備用。

2.2 紫丁香苷含量測定方法的建立

2.2.1 對照品溶液的制備 取紫丁香苷對照品適量，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）2 min溶解，再加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.171 2 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別取G1～G12批次根皮、S1～S12批次樹皮和Y4～Y12批次葉各1.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，分別加入甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流提取1 h，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜條件參考前期建立的方法[16]，并結(jié)合文獻(xiàn)方法[17-20]進(jìn)行優(yōu)化后設(shè)定。色譜柱為Agela Promosil C18（250 mm×4.6 mm，5? ? ? μm）;流動相為0.5%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，91.00%A;10～15 min，91.00%A→88.40%A;15～20 min，88.40%A→30.00%A;20～25 min，30.00%A;25～25.1 min，30.00%A→91.00%A;25.1～30 min，91.00%A）;流速為1.0 mL/min;檢測波長為210 nm;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為5 μL。取“2.2.1”項下對照品溶液和“2.2.2”項下供試品溶液（樣品編號：G1）適量，并以甲醇為空白對照，按此色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，待測成分峰與相鄰峰間的分離度大于1.50、拖尾因子介于0.95～1.05之間，理論板數(shù)按紫丁香苷峰不低于4 000，且空白對照無干擾，色譜圖見圖1。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取紫丁香苷對照品適量，按“2.2.1”項下方法制備質(zhì)量濃度為1.918 0 mg/mL的對照品貯備液。精密量取該貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于不同10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得到紫丁香苷的回歸方程為y=1.375 3x+0.002 4（r=0.999 6），表明紫丁香苷質(zhì)量濃度的線性范圍為0.095 9～1.150 8 mg/mL。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，紫丁香苷峰面積的RSD為2.16%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下同一個供試品溶液（樣品編號：G1）適量，于室溫下放置0、2、6、10、12、24 h時，分別按“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，紫丁香苷峰面積的RSD為2.34%（n=6），表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批次藥材（樣品編號：G1）粉末1.0 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并根據(jù)外標(biāo)法計算紫丁香苷含量。結(jié)果，紫丁香苷含量的RSD為2.67%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取同一批次已知含量的藥材（樣品編號：G1）粉末0.5 g，精密稱定，共6份，分別置于圓底燒瓶中，精密加入5.0 mL紫丁香苷對照品溶液[紫丁香苷質(zhì)量濃度為0.134 26 mg/mL（取“2.2.4”項下對照品貯備溶液適量以甲醇稀釋制得）]，稱定質(zhì)量;再分別加入95 mL甲醇，水浴回流提取1 h，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，根據(jù)外標(biāo)法計算紫丁香苷含量，并計算其加樣回收率。結(jié)果，紫丁香苷的平均加樣回收率為101.74%，RSD為1.39%（n=6），表明該方法準(zhǔn)確度較好。加樣回收率試驗結(jié)果見表2。

2.3 總黃酮含量測定方法的建立

2.3.1 蘆丁對照品溶液的制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加50%乙醇適量，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）2 min溶解后，再加入50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.361 0 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取“2.2.2”項下各供試品溶液，每份樣品精密量取5 mL，置于50 mL量瓶中，按文獻(xiàn)方法[11]，分別用5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、4%氫氧化鈉溶液依次進(jìn)行衍生化后，即得。

2.3.3 方法學(xué)考察 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取蘆丁對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、3.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用50%乙醇稀釋到刻度，搖勻。按文獻(xiàn)方法[11]進(jìn)行預(yù)處理，然后在510 nm最大吸收波長下進(jìn)行測定，并以50%乙醇為空白進(jìn)行調(diào)零，然后以蘆丁質(zhì)量濃度（c，mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到蘆丁的回歸方程為A=11.527 89c+0.049 7 8（r=0.999 9），表明蘆丁質(zhì)量濃度在0.072 2～1.083 0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。（2）其他方法學(xué)考察：按文獻(xiàn)方法[11]依次進(jìn)行總黃酮含量測定的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性考察。結(jié)果，精密度、穩(wěn)定性（室溫22 ℃、2 h）、重復(fù)性試驗的RSD依次為2.85%、2.16%、2.49%（n=6），平均加樣回收率為99.63%（RSD=2.19%，n=6），符合含量測定相關(guān)要求。

2.4 不同采收期大接骨丹中紫丁香苷和總黃酮含量比較分析

取“2.2.1”項下對照品溶液、“2.2.2”項下各批次樣品的供試品溶液，分別按“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并根據(jù)外標(biāo)法計算出樣品中紫丁香苷含量。分別取“2.3.2”項下各批次樣品的供試品溶液，用紫外-可見分光光度計在510 nm 波長處進(jìn)行檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中總黃酮含量。每個樣品均重復(fù)測定3次。結(jié)果顯示，在不同采收期內(nèi)，大接骨丹根皮、樹皮、葉部位中紫丁香苷含量分別在8、5、9月最高，總黃酮含量分別在2、12、9月最高。在3個用藥部位中，樹皮部位中紫丁香苷含量總體上相對較高，根皮部位次之，葉部位相對較低甚至檢測不到;總黃酮含量大小依次為根皮>樹皮>葉，且3個用藥部位中總黃酮含量均普遍較低。同時，在3個不同用藥部位中，根皮部位中總黃酮含量在當(dāng)年2月最高，且當(dāng)月根皮部位中紫丁香苷含量僅次于當(dāng)年8月，含量也相對較高;樹皮部位中紫丁香苷含量在5月達(dá)到峰值，且當(dāng)月樹皮部位中總黃酮含量僅次于當(dāng)年10、12月，相對較高;葉部位中紫丁香苷含量和總黃酮含量均在當(dāng)年9月最高。不同采收期大接骨丹根皮、樹皮、葉中紫丁香苷和總黃酮含量測定結(jié)果見表3、圖2。

3 討論

在預(yù)試驗中，筆者考察了回流提取法、超聲提取法、浸漬法、滲漉法等不同提取方法及甲醇、水、10%乙醇～90%乙醇、無水乙醇等不同提取溶劑對樣品中次生代謝產(chǎn)物紫丁香苷、總黃酮含量的影響，最終確定以甲醇為溶劑、采用水浴回流提取的方法進(jìn)行提取，該方法簡便易行、提取率高且相對穩(wěn)定。此外，筆者利用二極管陣列（DAD）檢測器檢測3個用藥部位中紫丁香苷含量時，分別考察了在8個檢測波長（210、220、230、240、250、260、270、280 nm）下的測定效果，結(jié)果在210 nm波長下紫丁香苷色譜峰的峰面積相對較大、峰形較好，且分離度較高，大接骨丹根皮、樹皮、葉樣品均能得到較好的檢測效果。因此，最終確定210 nm作為本研究中紫丁香苷HPLC法含量測定時的檢測波長。

通常，確定藥材最佳采收期時，在綜合考慮不同采收期內(nèi)各指標(biāo)性成分含量的同時，還需考慮藥材的最高或相對較高的生物產(chǎn)量。但由于本研究中藥材樣本屬于喬木，為多年生木本植物，與草本植物相比，計算其生物產(chǎn)量難度相對較高，故本研究在確定各藥用部位最佳采收期時未將生物產(chǎn)量作為其評價指標(biāo)。大接骨丹在民間以鮮品絞汁或搗爛外敷應(yīng)用居多，藥材采集較為隨機(jī)，無固定采收季節(jié)，民族醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床用藥時應(yīng)注重藥用部位及其有效成分的含量，可考慮固定采收季節(jié)以確保其臨床療效。結(jié)合本研究結(jié)果綜合考慮，建議大接骨丹根皮部位在2月采收為宜，樹皮部位在5月采收為宜，葉部位在9月采收為宜。

綜上，本文通過對不同采收期大接骨丹藥材不同用藥部位中紫丁香苷、總黃酮含量為代表的次生代謝產(chǎn)物經(jīng)時變化特征的研究，揭示了該藥材次生代謝產(chǎn)物動態(tài)積累規(guī)律，為該藥材后期的開發(fā)利用及臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，同時也為其質(zhì)量控制提供了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-04-18 修回日期：2020-07-09）

（編輯：林 靜）