1例冠狀病毒、大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌引起的犢牛腹瀉

王海燕 管遠(yuǎn)紅 蔡丙嚴(yán) 郭廣富 陳長春

摘要：犢牛腹瀉對養(yǎng)牛業(yè)造成了極大威脅和損失，其病因復(fù)雜，以傳染性病原體的威脅最大。2017年2—3月，江蘇某奶牛場的50多頭新生乳犢牛陸續(xù)出現(xiàn)腹瀉，發(fā)病率達(dá)到30%，用多種藥物治療后無效，犢牛的病死率達(dá)到100%。為了解其病因，筆者對病死犢牛進(jìn)行了剖檢，無菌采集腸系膜淋巴結(jié)、脾臟等進(jìn)行細(xì)菌分離，并取腹腔滲出液、腸道內(nèi)容物進(jìn)行處理和電鏡觀察。結(jié)果表明，從病樣中分離鑒定得到大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌，通過對處理的病料進(jìn)行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)了大量冠狀病毒樣顆粒;應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增冠狀病毒N蛋白基因部分片段，得到特異性目的片段大小的產(chǎn)物。使用頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林、卡那霉素、鏈霉素、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、大觀霄素、四環(huán)素、氯霉素、利福平、呋喃唑酮等藥物對分離菌進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離菌對供試藥物大多表現(xiàn)為耐藥，僅對頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉等表現(xiàn)為中度敏感。由研究結(jié)果可以看出，江蘇某奶牛場的病例是由冠狀病毒與2種細(xì)菌的混合感染所致，抗生素治療效果不好，由于存在混合感染，消毒和預(yù)防措施顯得更為重要。

關(guān)鍵詞：冠狀病毒;大腸桿菌;肺炎克雷伯氏菌;犢牛;腹瀉;病原學(xué)

中圖分類號：S858.237.3+4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0201-04

犢牛腹瀉是牛場生產(chǎn)過程中犢牛面臨的最主要的健康問題之一，是犢牛死亡的最常見的原因[1]。犢牛腹瀉是指新生10日齡左右的犢牛發(fā)生的一種以消化不良、腹瀉為主要癥狀的胃腸消化道疾病[2-4]，該病一年四季均可發(fā)生，尤其在初春、夏末、秋初氣候多變的季節(jié)多發(fā)，發(fā)病率高，哺乳期的犢牛更容易發(fā)生腹瀉，在世界范圍內(nèi)，奶牛場犢牛腹瀉發(fā)病率為20%～100%[5-10]。腹瀉往往是多種疾病的一種臨床表現(xiàn)，犢牛腹瀉的原因很多，包括犢牛本身的因素以及所處的環(huán)境、營養(yǎng)與傳染性因子等多種因素[1，11]。因此，以上原因造成發(fā)病犢牛在臨床上的表現(xiàn)各異，但是主要癥狀表現(xiàn)為腹瀉，在犢牛發(fā)病初期，犢牛往往排稀軟、水樣糞便;隨著病程的發(fā)展，犢?？赡鼙憩F(xiàn)出脫水的癥狀，如眼窩下陷、黏膜干燥、被毛焦燥等;隨著脫水癥狀的加重，患病犢?？赡鼙憩F(xiàn)出末梢發(fā)涼、食欲減退或廢絕、喜臥或難以站立、昏迷等癥狀[1-2]。腹瀉會造成新生犢牛死亡和發(fā)育不良，從而引起巨大經(jīng)濟(jì)損失，是牛場需要重點(diǎn)防控的疫病[1，12-13]。

2017年初江蘇某奶牛場產(chǎn)犢牛50多頭，新生犢牛陸續(xù)出現(xiàn)腹瀉，用多種藥物治療后均無明顯效果。筆者對死亡犢牛進(jìn)行剖檢和病原學(xué)研究。

1 病例情況與病死犢牛剖檢情況

某奶牛場存欄500頭左右，奶產(chǎn)量較高，每頭產(chǎn)奶牛平均每天產(chǎn)奶34 kg左右，2017年2月開始陸續(xù)產(chǎn)犢，初期吃初乳基本沒有問題，換常奶后發(fā)病。換常奶期間母牛飼料及飼養(yǎng)管理與以前相比沒有任何變化。出現(xiàn)腹瀉后，犢牛后軀被稀糞污染，使用拜有利、青霉素、百痢克等藥物（按廠家推薦劑量使用）進(jìn)行治療，對于體溫高的犢牛注射安乃近后，效果不佳，然后使用恩諾沙星、氟苯尼考等藥物（按廠家推薦劑量使用），效果仍不佳，最后增加使用中藥（白頭翁、黃連、黃柏、陳皮等），仍然不見好轉(zhuǎn)。一般病程為2～3周，發(fā)病率約30%，病死率為100%。

病死犢牛剖檢情況如下：主要見極度消瘦，嚴(yán)重脫水，體表被糞便污染（圖1）;齒齦出血、潰瘍;胸腔、腹腔、心包積液（圖2）;全身淋巴結(jié)腫大，出血（圖3）;腸道空虛（圖4），胃底出血。

無菌采集病死犢牛脾臟、肝臟、腎臟、腸系膜淋巴結(jié)等臟器放入無菌收集袋中;將胸腔、腹腔滲出液等放入高壓處理的指形管中保存。

2 實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢查

2.1 病毒學(xué)檢測

對采集的病死牛的臟器和滲出液等進(jìn)行處理和檢測。

2.1.1 電鏡觀察 將采集的病死犢牛胸腔、腹腔滲出液經(jīng)離心、濃縮處理后進(jìn)行負(fù)染，隨后在揚(yáng)州大學(xué)測試中心電鏡室進(jìn)行電鏡觀察。

2.1.2 分子生物學(xué)檢測 通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增牛冠狀病毒N蛋白編碼基因，上游引物序列為5′-CGATCAGTCCGACCAATCTA-3′，下游引物序列為5′-GAGGTAGGGGTTCTGTTGGG-3′[14-15]，預(yù)期擴(kuò)增的N基因產(chǎn)物片段大小為 597 bp。用TRIzol試劑提取病死犢牛腸道內(nèi)容物病毒總RNA用于反轉(zhuǎn)錄，具體參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。采用20 μL擴(kuò)增體系，其組成如下：1 μL cDNA，10 μL 2×PCR Mix，各0.5 μL上、下游引物，8 μL超純水。反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s，53 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán);72 ℃ 10 min。隨后電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果。

2.2 細(xì)菌的分離和鑒定

分別取病死犢牛脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟并無菌接種于血瓊脂平板上，同時(shí)進(jìn)行有氧和厭氧培養(yǎng)，于37 ℃培養(yǎng)18 h左右，觀察是否有菌落生成，若有，則進(jìn)行多次傳代純化，最終記錄菌落結(jié)果。

2.2.1 染色鏡檢 對純化得到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

2.2.2 生化試驗(yàn) 利用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管（購自杭州微生物試劑有限公司）對分離所得菌株進(jìn)行生化指標(biāo)的測定，操作方法與判定標(biāo)準(zhǔn)參照說明書。在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，與對照管比對，觀察反應(yīng)結(jié)果并記錄。

2.2.3 16S rDNA基因的擴(kuò)增與測序、分析 挑取4個典型菌落提取基因組DNA，利用煮沸法煮沸 10～15 min后離心、取上清，備用。PCR參照寶生物工程（大連）有限公司的TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR kit說明書進(jìn)行，采用25 μL擴(kuò)增體系，含有2 μL DNA模板，12.5 μL PCR Mix，各0.25 μL上、下游引物，10 μL 超純水。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，53 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后觀察結(jié)果，再將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。對測定的DNA序列進(jìn)行BLAST比對，根據(jù)同源性高低確定細(xì)菌的種屬。

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)

使用頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林、卡那霉素、鏈霉素、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、大觀霄素、四環(huán)素、氯霉素、利福平、呋喃唑酮等藥物紙片對分離得到的細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 病毒學(xué)檢測結(jié)果

由圖5可以看出，負(fù)染鏡檢可見大量冠狀病毒樣顆粒，完整的病毒粒子直徑為120～130 nm，花冠狀的病毒纖突清晰可見。

由圖6可以看出，從樣本中擴(kuò)增出了與牛冠狀病毒N蛋白編碼基因預(yù)期大小一致的核酸條帶。

3.2 細(xì)菌分離結(jié)果和菌落形態(tài)

于37 ℃培養(yǎng)18 h后，在有氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)的血瓊脂平板上均長出了菌落，未見溶血，其中有氧培養(yǎng)的菌落相對厭氧培養(yǎng)的稍大;肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，在有氧和厭氧培養(yǎng)的菌落特征中，除大小外無其他差異。進(jìn)一步純化發(fā)現(xiàn)，有氧培養(yǎng)的菌落中的一種較大，呈凸起、不透明、灰白狀，邊緣整齊，且邊緣由于遮光性和水分而似透明狀;另一種菌落稍小一些，呈稍凸起、不透明、灰白狀，邊緣整齊。

染色后的鏡檢結(jié)果表明，有氧和厭氧培養(yǎng)的細(xì)菌間無明顯差異。染色鏡檢結(jié)果顯示，有氧和厭氧培養(yǎng)的細(xì)菌均為粗短直桿菌，革蘭氏染色結(jié)果呈陰性。16S rRNA基因測序結(jié)果表明，分離菌分別為肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌。此外，生化發(fā)酵管試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這2種分離菌的生化特征。

3.3 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

用頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林、卡那霉素、鏈霉素、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、大觀霄素、四環(huán)素、氯霉素、利福平、呋喃唑酮等藥敏紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的結(jié)果表明，分離菌對很多藥物耐藥，對頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉的敏感性稍強(qiáng)，對大多數(shù)藥物完全耐藥。

4 結(jié)論和討論

犢牛發(fā)生腹瀉主要由飼養(yǎng)管理不當(dāng)、應(yīng)激、細(xì)菌、病毒及寄生蟲等方面的原因引起[1]。細(xì)菌中的大腸桿菌[16-18]、沙門氏菌[19]、彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌[1，20-24]，病毒中的輪狀病毒[25-28]、冠狀病毒[14-15]、星形病毒、微病毒，寄生蟲中的隱孢子蟲等均可造成該病的傳播和流行[1，29-30]。近年來，混合感染的報(bào)道越來越多，王丹陽等曾報(bào)道了牛病毒性腹瀉病毒、大腸桿菌和奇異變形桿菌混合感染引起的犢牛腹瀉[31];吳城等對福建省牛流行性腹瀉病毒和牛輪狀病毒混合感染進(jìn)行了調(diào)查[32]。此外，還有一些研究針對細(xì)菌性或病毒性的多種感染進(jìn)行了調(diào)查報(bào)道[29-30]。本研究中的病例是由冠狀病毒、大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌混合感染引起的，這也是首次報(bào)告。目前，多種病原體造成混合感染的病例越來越多，需要引起相關(guān)人員的重視。群體中的疾病發(fā)生時(shí)，各種復(fù)雜因素綜合作用會造成臨床表現(xiàn)復(fù)雜，剖檢病變也很復(fù)雜，此外，由于混合感染的病例越來越多，根據(jù)病史、臨床癥狀也很難作出診斷。疾病的確診必須依據(jù)腸道微生物、患犢糞便的檢查，甚至須要進(jìn)行病原學(xué)、分子生物學(xué)檢查或動物試驗(yàn)[1]。由于各種方法本身的限制性及臨床經(jīng)驗(yàn)的差異，檢測本身可能也存在漏檢問題，也因此造成臨床用藥效果不佳。隨著藥的種類越來越多，量也可能越來越大，從而產(chǎn)生耐藥性，這樣就會形成惡性循環(huán)，因此，確診就顯得非常重要，篩檢的項(xiàng)目也須要增加。在本試驗(yàn)剖檢結(jié)果中出現(xiàn)了很多與腹瀉無關(guān)的病變，可能是由病程長、施用多種干預(yù)措施與繼發(fā)感染等導(dǎo)致的。所以，很多剖檢變化不能作為指征性的病變，在這類疾病的診斷過程中要注意相關(guān)問題。

在本試驗(yàn)中檢測出了3種病原體，其中1種是冠狀病毒，該病毒雖然不是造成犢牛腹瀉的主要病原體，但是在本例的腸道和滲出物中出現(xiàn)了大量病毒顆粒，說明該病原體在致病過程中起到重要作用。而在淋巴結(jié)和多種臟器中均分離到了2種細(xì)菌病原體（大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌），說明它們在致病過程中也有一定作用，但是由于各種因素的制約，很難對其致病性進(jìn)行明確。

大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌均屬于腸道桿菌，很多生物學(xué)特性相似，在區(qū)分時(shí)并不是非常明顯，從而給診斷帶來了一定困難，有時(shí)候甚至?xí)霈F(xiàn)漏診。此外，在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌落稍有差異，因此在進(jìn)行16SrRNA基因測序時(shí)選擇幾個不同的單個菌落進(jìn)行測定才發(fā)現(xiàn)有2種菌落，進(jìn)而進(jìn)行回顧性菌落鑒定，差點(diǎn)造成誤診。2種細(xì)菌的耐藥譜廣、耐藥性強(qiáng)，與臨床上用藥效果不佳有一定關(guān)系。在本試驗(yàn)的治療過程中雖然也使用了中藥，但是由于中藥以調(diào)理為主，因此在這種急性病例中的效果不明顯。

在我國，種牛、冷凍精液的引進(jìn)給我國的奶牛養(yǎng)殖帶來了一定風(fēng)險(xiǎn)，雖然大多數(shù)養(yǎng)殖場都是從正規(guī)企業(yè)購進(jìn)種牛的，但是多種病原體的間歇性帶毒問題給檢測工作帶來了一定難度，再加上由于成本的增加，由非正規(guī)途徑獲得的冷凍精液的風(fēng)險(xiǎn)更高，例如很多西方國家牛場的牛病毒性腹瀉非常嚴(yán)重。因此，規(guī)范引種、引進(jìn)冷凍精液或胚胎至關(guān)重要[1-2]。加強(qiáng)生物安全是該病防控的重點(diǎn)[32-34]，但是生物安全是一系列工作的集成，一旦某個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，將造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[35]。奶牛場的管理者和獸醫(yī)在平時(shí)工作中應(yīng)對各種生物安全措施進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，查漏補(bǔ)缺，抓重點(diǎn)措施和影響較大的措施，這樣即使出現(xiàn)問題，也是小的問題，從而將損失降到最低。

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