酚磺乙胺對酶法檢測血清尿酸的影響*

井 沆，牛志杰，劉子硯，凌曉午，李青青，武紅權(quán)△

1.貴州省人民醫(yī)院檢驗科，貴州貴陽 550002；2.首鋼水鋼總醫(yī)院腫瘤科，貴州六盤水 553000

尿酸(UA)是嘌呤核酸的代謝產(chǎn)物[1-2]，在腎功能治療方面起著重要的作用。酚磺乙胺又名止血敏，通過加速血液凝固發(fā)揮止血作用[3]，臨床工作中，發(fā)現(xiàn)有患者應(yīng)用酚磺乙胺治療后血清UA檢測結(jié)果變化很大，與患者的臨床表現(xiàn)有較大差異，有研究稱酚磺乙胺對肌酐結(jié)果存在藥物干擾[4-5]，而對UA可能存在干擾的具體研究尚未見報道。

本研究依據(jù)CLSI EP7-A2[6]和文獻[7]推薦的干擾試驗方法，通過體外干擾試驗，探討酚磺乙胺對酶法檢測UA的干擾。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年10月來貴州省人民醫(yī)院就診患者的新鮮血清，并配制低、高水平混合血清各一份。納入標準：(1)未用藥治療的血清標本；(2)標本無黃疸、無脂血、無溶血；(3)UA的測試水平為EP7-A2和指南建議的干擾試驗水平。

1.2儀器與試劑 美國雅培C16000全自動生化分析儀。酚磺乙胺注射液由國藥集團容生制藥有限公司提供，國藥準字號為H20057257，規(guī)格0.5 g/2 mL。根據(jù)《中華人民共和國藥典》[8]及酚磺乙胺藥代動力學(xué)特性[9]，本研究采用0.5 g/L酚磺乙胺的最高血藥濃度。酶法UA檢測試劑及配套校準品(美國雅培公司，批號08465UN19)。試驗前對檢測儀器進行精密度評估，用試劑原裝標準品對儀器項目進行校準并進行定期質(zhì)控，觀察檢測方法的穩(wěn)定性，室內(nèi)質(zhì)控品為美國伯樂公司(Bio-Rad)提供的生化多項質(zhì)控物，兩個水平，批號為26421、26422。

1.3方法

1.3.1干擾篩選試驗 (1)取酚磺乙胺注射液1瓶(250 g/L)與生理鹽水按照1∶50比例配置成酚磺乙胺水平為5 g/L的試驗樣品(原液)，將UA水平為500 μmol/L左右的混合血清與原液按照9∶1的比例配制成酚磺乙胺水平為500 mg/L的溶液，另用UA血清和生理鹽水以同比例混合作為對照品，分析酚磺乙胺對酶法UA測定的干擾程度。(2)對生化儀進行UA校準、定期質(zhì)控和精密度評估，觀察檢測方法的準確性。(3)按交互順序分析檢測樣品和對照樣品并記錄試驗結(jié)果。

1.3.2干擾劑量效應(yīng)試驗 根據(jù)指南要求，被測UA試驗水平的確定，宜選取被測量的2個醫(yī)學(xué)決定水平作為干擾試驗時的被測量水平。本試驗依據(jù)UA參考范圍的低限或病理水平，同時結(jié)合指南關(guān)于被測量UA的建議試驗水平，選取UA值為180 μmol/L、450 μmol/L作為劑量效應(yīng)試驗水平。

預(yù)稀釋：取一支酚磺乙胺溶液，配置成藥物水平為5 000.00、3 000.00、1 500.00、750.00、375.00、187.50、93.80、46.90、23.50、0.00 mg/L，一共10個水平。將高、低兩種不同水平的UA混合血清與上述方法配制的不同水平的酚磺乙胺溶液按照9∶1的比例配制成上述酚磺乙胺水平梯度的溶液(試驗組)，對照組按上述步驟將酚磺乙胺注射液換成生理鹽水，并按照相應(yīng)比例將試驗組與對照組樣品分別配制成干擾物水平為500.00、300.00、150.00、75.00、37.50、18.75、9.38、4.69、2.35、0.00 mg/L的藥物干擾劑量效應(yīng)測試標本，每個標本重復(fù)檢測3次[10]。

1.3.3重復(fù)測量 根據(jù)指南中基于生物學(xué)變異質(zhì)量規(guī)范中允許總誤差(Tea%)和臨床專家的共識，本研究選擇以UA偏差11.9%作為干擾試驗的可接受標準(dmax)，UA批內(nèi)標準差(s)通過標本重復(fù)測定10次計算得出，再計算出二者比值dmax/s，采用95%置信區(qū)間(CI)，根據(jù) EP7-A2文件附表得出干擾篩選試驗的重復(fù)測量次數(shù)為3次。

1.3.4干擾效應(yīng)分析 干擾篩選試驗：用試驗樣品與對照樣品測定均值間的偏差(dabs)表示干擾效果，分別計算干擾值(dabs)和dabs95%CI，dabs95%CI=dabs±t0.975，n-1×(2s2/n)1/2。

干擾的判斷標準：當(dāng)|dabs95%CI最低值|≤dmax時，則可判斷由被評價干擾物所致的偏差未超過允許誤差，不認為此物質(zhì)為干擾物，反之則認為被評價干擾物對被評價方法有明顯干擾作用。

干擾劑量效應(yīng)試驗：將檢測的不同水平的干擾物試驗樣品均值分別減去對照品均值得到單獨的dabs值，再用SPSS 22.0軟件制作酚磺乙胺干擾物水平(X軸)和單獨的dabs(Y軸)的散點圖，再對數(shù)據(jù)進行回歸分析曲線估計，選取相關(guān)系數(shù)R2最高的曲線模型，繪制干擾劑量效應(yīng)試驗的效應(yīng)圖，并用軟件算出干擾效應(yīng)曲線的回歸方程。

2 結(jié) 果

2.1干擾篩選試驗 根據(jù)EP7-A2文件附表，s為1.50，dmax為59.13 μmol/L、dmax/s>3，故單個標本重復(fù)檢測次數(shù)為3次，試驗組(酚磺乙胺水平50 mg/L)均值為270.33 μmol/L，對照組均值為496.86 μmol/L，dabs=試驗組均值-對照組均值=-226.53 μmol/L，dabs95%CI=(-226.53±1.96)μmol/L，|dabs95%CI最低值|>dmax。

2.2干擾劑量效應(yīng)試驗 酚磺乙胺水平在0.00～500.00 mg/L所對應(yīng)低、高UA樣品的dabs值見表1，干擾劑量效應(yīng)回歸曲線分析圖見圖1、2。低值UA(182.86 μmol/L)樣品，用計算機得出干擾劑量效應(yīng)回歸方程顯著性檢驗F=1 596.39，R2=0.995，P<0.001，酚磺乙胺藥物濃度在<29.84 mg/L時的|dabs|

表1 高、低系列干擾劑量效應(yīng)樣品對應(yīng)的dabs值(μmol/L)

圖1 酚磺乙胺與低水平UA干擾劑量效應(yīng)回歸曲線

圖2 酚磺乙胺與高水平UA干擾劑量效應(yīng)回歸曲線

3 討 論

不精密度、方法特異性偏差和干擾等都可造成患者檢出值與真實值之間的偏差，在本試驗中，選擇的是雅培原裝UA試劑，該項目均全年參加國家衛(wèi)生健康委員會室間質(zhì)評，結(jié)果成績優(yōu)異，本實驗室為ISO15189認可實驗室，運行著一套完整且嚴格的質(zhì)量管理體系，故在本試驗中樣品的檢測出值與真實值之間的差距為干擾物質(zhì)所造成的。

藥物干擾試驗是用來衡量檢測方法準確度的一個重要指標，通過在反應(yīng)過程中加入一定量的干擾藥物，來測試是否會對檢測結(jié)果造成影響。干擾物質(zhì)的水平不同，造成的干擾結(jié)果也不同。本試驗根據(jù)EP7-A2和文獻[7]提供的方案來制訂干擾篩選試驗和干擾劑量效應(yīng)試驗。酚磺乙胺干擾劑量效應(yīng)試驗的藥物濃度是依據(jù)其動力學(xué)特點盡可能選擇藥物進入人體后所能夠達到的峰值水平，模擬藥物濃度在人體的相對濃度，保證試驗的真實性、準確性。干擾試驗的臨床可接受標準并無明確指標，在EP7-A2文件和文獻[7]中提出了一些參考的依據(jù)，包括部分分析物的準確度要求、基于生物學(xué)變異的質(zhì)量規(guī)范以及臨床專家的意見等。本研究綜合以上各因素確定選用基于生物學(xué)變異的質(zhì)量規(guī)范中Tea%的期望值作為dmax。

本研究應(yīng)用 EP7-A2 文件體外研究分析酚磺乙胺對UA項目的干擾，它的試驗思路是先進行干擾篩選試驗，在高濃度下判斷藥物是否會造成干擾，在確定酚磺乙胺有干擾效應(yīng)后，可通過干擾劑量效應(yīng)試驗具體評估不同酚磺乙胺水平與干擾程度的關(guān)系。根據(jù)本次試驗干擾篩選試驗的結(jié)果|dabs95%CI最低值|>dmax，說明酚磺乙胺對UA 存在嚴重顯著負干擾[10]。本試驗UA的反應(yīng)原理為UA的測定應(yīng)用UA酶法，UA經(jīng)UA酶氧化生成尿囊素，同時生成過氧化氫(H2O2)。H2O2在過氧化物酶(POD)的作用下與4-氨基安替比林(4-AAP)和N-(3-磺丙基)-3-甲氧基-5-甲基苯胺(HMMPS)反應(yīng)生成一種琨亞胺染料，604 nm處吸收光度的改變與標本中UA的水平呈正比。查閱文獻并結(jié)合UA酶法原理發(fā)現(xiàn)，血清中的UA是在酶催化作用下生成H2O2，H2O2又繼續(xù)參與Trinder反應(yīng)從而形成紅色醌亞胺化合物，最后進行比色得出結(jié)果[11]。H2O2酶的特異性較低，一些還原物質(zhì)如維生素C和谷胱甘肽可與色原性物質(zhì)競爭H2O2，從而干擾氧化酶法的測定。而酚磺乙胺作為一種還原性物質(zhì)，能對最終通過氧化反應(yīng)產(chǎn)生色度改變的檢測項目產(chǎn)生負干擾。同時干擾劑量效應(yīng)試驗分析結(jié)果得出，酚磺乙胺對酶法檢測UA存在負干擾，且藥物濃度越高對檢測結(jié)果的負干擾程度越大。在低、高水平UA樣品中，酚磺乙胺的水平分別在<29.84 mg/L和<44.43 mg/L時，負干擾程度未超過干擾試驗的dmax。

由酚磺乙胺藥代動力學(xué)特性可知，靜脈注射后1 h血藥濃度達到高峰，作用持續(xù)4～6 h，平均峰值300 mg/L，血中半衰期為5 h，4個半衰期排泄93.75%[12]。酚磺乙胺對UA能夠產(chǎn)生干擾所需的最小濃度為血藥峰值濃度的9.95%～14.81%，為盡量避免其對檢驗結(jié)果的干擾，建議使用酚磺乙胺的患者檢測UA時，應(yīng)在用藥至少24 h 后進行抽血檢測。對于腎功能代謝功能差的患者，可能需要更長時間關(guān)注酚磺乙胺藥物對UA的干擾。

針對酚磺乙胺對檢測UA所存在的干擾，腎功能不全患者用藥后檢測結(jié)果差異，建議服用酚磺乙胺患者的血清檢測結(jié)果在臨床評價時需加以高度警惕，當(dāng)知道患者使用過酚磺乙胺以后，或者發(fā)現(xiàn)患者的UA結(jié)果與上次相比有明顯下降的趨勢，要考慮可能是藥物影響檢測結(jié)果，或采取另外的檢測方法來進行復(fù)檢，以便對患者腎功能做出正確、客觀的評價。