童卓云， 斯依提·阿木提， 劉文娟， 張盼盼， 阿地力江·伊明

(1新疆維吾爾自治區(qū)第八人民醫(yī)院檢驗科， 烏魯木齊 830000; 2新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織規(guī)定，育齡期夫婦在1年以上未進(jìn)行任何避孕措施下，進(jìn)行有規(guī)律的性生活仍無法受孕為不孕不育癥，男性則為不育癥。近年來，男性不育癥患病率呈增長趨勢，精液質(zhì)量呈逐年降低趨勢[1-2]。研究表明，全球約15%育齡夫婦面臨不孕不育的困擾[3]，亞洲地區(qū)僅男性因素造成的不孕不育達(dá)37 %。有學(xué)者通過冷水浸沒[4]、短期冷暴露[5]等急性造模方式進(jìn)行了冷刺激對精子功能影響的研究和報道，但是，將冷環(huán)境作為致病因素，將弱精子癥作為一項疾病，模擬其發(fā)生發(fā)展過程并建立模型的系統(tǒng)性研究則鮮有報道。本研究采用冷環(huán)境刺激干預(yù)建立弱精子癥大鼠模型，探究弱精子癥大鼠精子功能及其性腺軸神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制的改變，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器DHP-360型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市光明醫(yī)療儀器有限公司)；GC-2016型γ放射免疫計數(shù)器(安徽科大創(chuàng)新股份有限公司)。

1.2 試劑M199培養(yǎng)基(美國Hyclone公司，批號：AE27981284)；胎牛血清(德國BIO-FROXX公司，批號：EZ2811F232)；精子伊紅-苯胺黑活體染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：20190423)。

1.3 實驗動物SPF級清潔雄性SD大鼠28只，體質(zhì)量(190±10)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2018-0002。

1.4 建模與分組方法取28只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(12只)和冷刺激建模組(16只)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將2組大鼠分別在正常溫度環(huán)境(22±2)℃和冷環(huán)境(4.0±0.5)℃，10：00～18：00中飼養(yǎng)，光控晝/夜12 h/12 h，大鼠均自由進(jìn)食飲水。23周后取冷刺激建模組大鼠精子，參照文獻(xiàn)[1]中方法進(jìn)行精子懸液制備和精子活力檢測與評定，即以前向運(yùn)動精子(Progressive motility, PR)百分率低于32 %，或前向+非前向運(yùn)動精子(Progressive motility+Non-progressive motility, PR +NP)百分率低于40 %為弱精子癥大鼠篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果弱精子癥組(8只)，未成模組(8只)，見圖1。

28只性SPF級SD大鼠正常對照組12只冷刺激建模組16只 23周后精子活力檢測23周后精子活力檢測 正常對照組12只未成模組8只精子癥組8只

1.5 組織取材與處理方法造模結(jié)束后將各組大鼠稱重后麻醉，腹主動脈采血制備血清，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ〈笫笞髠?cè)附睪制作精子懸液，將大鼠下丘腦、垂體、右側(cè)睪丸和右側(cè)附睪用4 %甲醛固定。

1.6 指標(biāo)測定

1.6.1 精子功能的評定 鈍性分離大鼠左側(cè)附睪尾，剔除周圍脂肪及結(jié)締組織，置于4 mL含有2% BSA的M199培養(yǎng)基中(提前37℃預(yù)熱)，用眼科剪將附睪尾迅速剪碎， 37℃孵育15 min。精子懸液參照參考文獻(xiàn)[1]中方法操作測定精子濃度和活力，參照精子伊紅-苯胺黑活體染色試劑盒說明書方法操作測定精子活率。

1.6.2 器官系數(shù)的測定 稱取各組大鼠睪丸和附睪重量，計算器官系數(shù)。

1.6.3 外周血清性腺軸激素水平的測定 參照放射免疫檢測試劑盒說明書方法操作測定血清中睪酮(Testosterone, T)、雌二醇(Estradiol, E2)、黃體生成素(Luteinizing hormone, LH)、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone, FSH)、泌乳素(Prolactin, PRL)水平。

1.6.4 下丘腦、垂體、睪丸、附睪組織形態(tài)學(xué)觀察 取各組大鼠下丘腦、垂體、睪丸、附睪組織用4%甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片。HE染色，光鏡下觀察各組組織形態(tài)學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1 冷刺激建模組大鼠精子濃度、活力、活率的比較與正常對照組相比，冷刺激建模組大鼠精子活力(PR、NP)和活率均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.2 弱精子癥模型組大鼠精子濃度、活力、活率的比較與正常對照組相比，弱精子癥組大鼠精子活力(PR、NP)和活率均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表1 冷刺激對大鼠精子濃度、活力和活率的比較

表2 各組大鼠精子濃度、精子活力、精子活率的比較

2.3 各組大鼠弱精子癥成模率的比較與正常對照組相比，冷刺激建模組大鼠弱精子癥成模率增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，χ2=28.000)，見表3。

表3 各組大鼠弱精子癥成模率的比較

2.4 各組大鼠精子伊紅-苯胺黑活率染色結(jié)果比較染色后活精子頭部呈白色，死精子頭部呈紅色。與正常對照組相比，弱精子癥組較多見頭部紅染的精子，見圖2。

a.正常對照組

b.未成模組

c.弱精子癥組

2.5 各組大鼠器官系數(shù)的比較與正常對照組相比，弱精子癥組大鼠睪丸系數(shù)和附睪系數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與未成模組相比，弱精子癥組大鼠睪丸系數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

2.6 各組大鼠外周血清性腺軸激素含量的比較與正常對照組相比，未成模組、弱精子癥組T含量上升，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與正常對照組、未成模組相比，弱精子癥組E2水平升高，LH水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表4 各組大鼠睪丸、附睪系數(shù)的比較

2.7 各組大鼠性腺軸相關(guān)組織結(jié)構(gòu)改變情況

2.7.1 下丘腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 低倍鏡下正常對照組大鼠下丘腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞豐富，未成模組無明顯改變；高倍鏡下可見弱精子癥組大鼠下丘腦組織毛細(xì)血管呈袖套狀改變，神經(jīng)元細(xì)胞增生，排列紊亂，見圖3。

表5 各組大鼠外周血清性腺軸激素水平的比較

a.正常對照組 (×100)

b.未成模組 (×100)

c.弱精子癥組 (×100)

d.正常對照組 (×400)

e.未成模組 (×400)

f.弱精子癥組 (×400)

2.7.2 垂體組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 低倍鏡下正常對照組大鼠垂體組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞呈團(tuán)索狀分布， 弱精子癥組嗜堿性細(xì)胞較少；高倍鏡下冷刺激建模組大鼠垂體組織可見細(xì)胞空泡化、細(xì)胞水腫及毛細(xì)血管擴(kuò)張，以弱精子癥組更為明顯，見圖4。

2.7.3 睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 低倍鏡下正常對照組大鼠睪丸組織多見生精小管緊密排列，生精小管飽滿，以富含精子的生精小管為主。與正常對照組相比，未成模組未見明顯變化，弱精子癥組生精小管間距略寬，高倍鏡下弱精子癥組生精上皮較正常對照組薄，間質(zhì)水腫，可見毛細(xì)血管擴(kuò)張，見圖5。

2.7.4 附睪組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 低倍鏡下正常對照組大鼠附睪組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；高倍鏡下正常對照組大鼠附睪組織上皮細(xì)胞排列整齊，與正常對照組相比，未成模組、弱精子癥組上皮結(jié)構(gòu)均排列紊亂，上皮變薄，并以弱精子癥組更為明顯，見圖6。

a.正常對照組 (×100)

b.未成模組 (×100)

c.弱精子癥組 (×100)

d.正常對照組 (×400)

e.未成模組 (×400)

f.弱精子癥組 (×400)

a.正常對照組 (×100)

b.未成模組 (×100)

c.弱精子癥組 (×100)

d.正常對照組 (×400)

e.未成模組 (×400)

f.弱精子癥組 (×400)

3 討論

弱精子癥作為男性不育的重要原因之一，與男性生活環(huán)境、氣候、物理化學(xué)損傷及生活方式有關(guān)。近年來基于弱精子癥模型研究不斷增加，弱精子癥動物模型多采用化學(xué)損傷[6]、電離輻射等急性損傷方式建立[7]。本研究經(jīng)過23周的慢性、長期冷環(huán)境刺激后，冷刺激建模組大鼠精子活力、活率較正常對照組降低，其中PR降低42.55%，PR+NP降低43.51%，活率降低57.12%，有50%大鼠出現(xiàn)弱精子癥，弱精子癥組較正常對照組PR和PR+NP分別降低82.97%和 79.08%，精子活率則降低57.12%，表明穩(wěn)定的冷環(huán)境慢性、長期刺激下，不僅可以從精子的運(yùn)動能力和活率層面影響精子功能，進(jìn)一步發(fā)展后還可形成弱精子癥模型。有報道稱冷水浸沒可導(dǎo)致精子活力降低[4]，與本研究結(jié)果一致，但該研究中冷刺激未引起精子濃度的改變，究其原因可能是大鼠對全身冷環(huán)境刺激與睪丸局部冷刺激產(chǎn)生反應(yīng)的不同有關(guān)。

a.正常對照組 (×100)

c.弱精子癥組 (×100)

d.正常對照組 (×400)

e.未成模組 (×400)

f.弱精子癥組 (×400)

精子的產(chǎn)生和運(yùn)動能力有賴于正常的性激素水平，睪丸作為生殖腺，不僅是產(chǎn)生生殖細(xì)胞的器官，同時也產(chǎn)生性激素，發(fā)揮內(nèi)分泌功能，受到上級性腺軸激素的調(diào)控，其中腺垂體分泌的LH和FSH可對睪丸生精功能發(fā)揮調(diào)控作用[9]。LH主要作用于睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生T，而FSH主要作用于支持細(xì)胞并維持其細(xì)胞數(shù)量與功能[10]，促進(jìn)生精小管產(chǎn)生精子，控制T向E2轉(zhuǎn)化[11]。睪丸內(nèi)高濃度T在精子的生成與成熟過程中發(fā)揮著重要作用，T水平不足可影響精子發(fā)生，導(dǎo)致精子濃度降低[12]。與此同時雌激素在生精過程中也起重要作用，涉及精子正常發(fā)育及形成過程[13-14]。精子自身合成E2可提高精子的運(yùn)動能力和活率[15-16]。但過高水平E2反而會降低精子運(yùn)動能力，引起不育[17-18]。因此，致病因素可通過損害性腺軸，發(fā)揮對生殖系統(tǒng)發(fā)育的損害作用[19]。長期冷環(huán)境刺激，使雄性大鼠呈現(xiàn)性腺軸激素紊亂的狀態(tài)，其中E2水平的升高在弱精子癥模型的形成中可能發(fā)揮著重要作用，包括通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)降低血清LH。T水平升高，無統(tǒng)計學(xué)意義，具體機(jī)制尚不清楚。有研究者[5]將勃蘭特田鼠暴露于4℃冷環(huán)境時發(fā)現(xiàn)， T水平在造模后期由降低變?yōu)樯?。因此，T水平變化可能與冷刺激干預(yù)周期有關(guān)。性腺軸形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，弱精子癥組下丘腦、垂體及睪丸、附睪均產(chǎn)生不同程度的水腫樣病理改變，可能和炎性改變有關(guān)。下丘腦中神經(jīng)元細(xì)胞增生、排列紊亂、毛細(xì)血管袖套改變及垂體中嗜堿性細(xì)胞較少可解釋弱精子癥組顯著降低的LH水平。結(jié)合睪丸、附睪系數(shù)的變化，該弱精子癥模型的發(fā)生發(fā)展中，性腺軸的神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂應(yīng)發(fā)揮著重要的作用。綜上所述，冷環(huán)境長期刺激下可影響大鼠精子的運(yùn)動能力，進(jìn)而誘發(fā)弱精子癥，其機(jī)制與性腺軸內(nèi)分泌功能改變相關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制尚待進(jìn)一步研究證實。