西紅花苷對(duì)子宮腺肌病異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞生長周期的影響及機(jī)制研究

周江妍　宋曉園　徐黎賢

[摘要] 目的 研究西紅花苷對(duì)子宮腺肌病異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞生長周期及凋亡的影響，從細(xì)胞水平初步探討西紅花苷在子宮腺肌病中的治療作用。 方法 2018年1～6月收集江西省婦幼保健院術(shù)后病理確診為子宮腺肌病標(biāo)本，不同濃度西紅花苷（0、200、300、400、500 μg/mL）作用于異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞后，分別在培養(yǎng)0、24、48、72、96 h取出，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖; Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;PI單染檢測細(xì)胞周期。 結(jié)果 CCK-8法檢測西紅花苷濃度分別為200、300、400、500 μg/mL作用細(xì)胞72 h后，細(xì)胞抑制率分別為（7.60±0.03）%、（11.50±0.10）%、（18.26±0.14）%、（20.62±0.09）%，濃度為400 μg/mL、500 μg/mL組增殖抑制率明顯高于濃度為200 μg/mL組，結(jié)果顯示不同濃度西紅花苷對(duì)子宮腺肌病異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，與藥物濃度及時(shí)間呈正比，隨著西紅花苷濃度的升高和作用時(shí)間的延長，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率也越高;不同濃度西紅花苷作用細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測到子宮腺肌病異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡率隨濃度的增加而增大，細(xì)胞周期G0/G1期比例增多。 結(jié)論 西紅花苷在體外能顯著抑制子宮腺肌病異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，這些結(jié)果在細(xì)胞水平上顯示西紅花苷可用于臨床治療子宮腺肌病。

[關(guān)鍵詞] 子宮腺肌病;間質(zhì)細(xì)胞;西紅花苷;細(xì)胞增殖;凋亡

[中圖分類號(hào)] R711.7 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）23-0045-05

Impacts and mechanism study of crocin on the growth cycle of ectopic endometrial stromal cells in adenomyosis

ZHOU Jiangyan1 ? SONG Xiaoyuan2 ? ?XU ?Lixian1

1.Department of Gynecology， Jiangxi Maternal and Child Health Hospital， Nanchang ? 330006， China; 2.Department of Chemical Medicine， Ganzhou Institutes for Food and Drug Control in Jiangxi Province， Ganzhou ? 341000， China

[Abstract] Objective To explore the impact of crocin on the growth cycle and apoptosis of ectopic endometrial stromal cells in adenomyosis， and to preliminarily investigate the therapeutic effect of crocin on adenomyosis from cells level. Methods From January to June 2018， specimens of adenomyosis confirmed by postoperative pathology in Jiangxi Maternal and Child Health Hospital were collected. After crocin （0， 200， 300， 400， 500 μg/mL） of different concentrations performed on ectopic endometrial stromal cells， they were taken out after 0，24，48，72，96 hours of culture respectively，and cell proliferation was detected by CCK-8 method. Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry was used to detect cell apoptosis. PI single staining was used to detect cell cycle. Results The cell inhibition rates were（7.60±0.03）%， （11.50±0.10）%， （18.26±0.14）%， （20.62±0.09）%， respectively after different concentrations of crocin of 200， 300， 400， 500 μg/mL applied to the cells for 72 h detected by the CCK-8 method. The proliferation inhibition rate of 400 μg/mL、500 μg/mL were significantly higher than that of the 200 μg/mL group. The results showed that crocin of different concentrations had obvious inhibition effect on the proliferation of ectopic endometrial cells of adenomyosis，which was proportional to the drug concentration and time. The higher of crocin concentration and the longer of acting time， the higher of the cell proliferation inhibition rate. 48 hours after crocin at different concentrations acted on cells， flow cytometry detected that with the increase of concentration， the apoptosis rate of ectopic endometrial stromal cells in adenomyosis increased and the G0/G1 phase ratio of cell cycle increased. Conclusion Crocin can significantly inhibit proliferation of ectopic endometrial stromal cells of adenomyosis in vitro， induce apoptosis， lead cell cycle to G0/G1 phase， suggesting from cell levels that crocin can be used for clinical treatment of adenomyosis.

[Key words] Adenomyosis; Stromal cells; Crocin; Cell proliferation; Apoptosis

子宮腺肌病是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細(xì)胞向肌層浸潤并彌漫性生長的良性疾病，其發(fā)病率有逐漸增高的趨勢，已成為人們?nèi)找嬷匾暤膵D科難治癥之一[1]。目前其病因尚不明確，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)進(jìn)行性加重、子宮增大、月經(jīng)量過多、經(jīng)期延長等，嚴(yán)重影響廣大婦女的生活質(zhì)量及身心健康[2-4]。在治療上西醫(yī)包括藥物治療、手術(shù)及介入治療，除子宮全切術(shù)的根除性手術(shù)治療外，其他方法治療后的療效不甚滿意，且復(fù)發(fā)率高，副作用大，患者難以接受。子宮腺肌病屬中醫(yī)的“痛經(jīng)”、“癥瘕”等范疇，而中醫(yī)藥在治療痛經(jīng)、癥瘕等方面有顯著的優(yōu)勢和特色，不需手術(shù)且副作用小，患者容易接受。西紅花苷是活血化瘀中藥，具有疏經(jīng)活絡(luò)、通經(jīng)化淤、散郁開結(jié)、消腫止痛的功效，常用于婦科治療[5]。西紅花苷是西紅花中分離的有效單體成分之一，具有抗腫瘤活性，能高度抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，而不影響正常細(xì)胞的生長繁殖，在抗腫瘤的藥理作用上可能是多靶點(diǎn)多途徑的，如誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制惡性增殖，影響細(xì)胞周期及分化、抑制炎性因子表達(dá)，控制多藥耐藥性等[6，7]。目前還沒有西紅花苷對(duì)子宮腺肌病影響的研究報(bào)道，本文旨在細(xì)胞水平上探索西紅花苷對(duì)子宮腺肌病的作用，為臨床治療子宮腺肌病提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 組織標(biāo)本 ?2018年1～6月收集江西省婦幼保健院術(shù)后病理確診為子宮腺肌病標(biāo)本5份，患者年齡35～50歲，月經(jīng)規(guī)律。入選標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未接受任何激素治療;術(shù)前6個(gè)月內(nèi)無妊娠及哺乳史;無甲亢、甲減等代謝性疾病;無高血壓、糖尿病、心臟病等慢性疾病;近2周未服用激素類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：絕經(jīng)、急、慢性炎癥性疾病，合并卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫、免疫系統(tǒng)疾病及吸煙患者除外[8]。所有入選的患者遵循自愿原則并簽署知情同意書。本實(shí)驗(yàn)符合赫爾辛基原則，經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 ?西紅花苷由贛州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心提供，批號(hào)為17304。配制西紅花苷母液：稱取藥物粉末1 g，溶于10 mL PBS中，規(guī)格為0.22 μm濾器過濾除菌，獲得濃度為10 mg/mL的母液，分裝備用。

1.1.3 所需試劑 ?DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清、含EDTA的胰酶等細(xì)胞培養(yǎng)用品均為Hyclone公司產(chǎn)品;CCK-8試劑盒、凋亡及周期檢測試劑盒均來自上海貝博生物。

1.1.4 所用儀器 ?細(xì)胞培養(yǎng)箱（2046-II，美國），酶標(biāo)儀（iMark，美國），流式細(xì)胞測定儀（FC500，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定 ?子宮腺肌病灶組織收集后，立即置冰上，30 min內(nèi)到超凈臺(tái)，參照文獻(xiàn)[9]分離、純化培養(yǎng)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)消化、過濾、差速貼壁培養(yǎng)、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞。將（11.50±0.10）含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。后續(xù)取對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞用于功能實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 ?0.25% EDTA-胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整單細(xì)胞密度為1×103個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL，邊緣孔用PBS填充，每個(gè)處理組做5個(gè)重復(fù)。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為5組，各組加入藥物西紅花苷的終濃度為0、200、300、400、500 μg/mL。西紅花苷0 μg/mL組為不加藥物的正常對(duì)照組。設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)0、24、48、72、96 h的時(shí)間點(diǎn)取出，按檢測試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀上測定每孔OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。細(xì)胞增殖抑制率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（西紅花苷0 μg/mL組OD值-空白對(duì)照組OD值）]×100%。

1.2.3 PI-AnnexinⅤ-FITC標(biāo)記流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞凋亡 ?將指數(shù)期生長的細(xì)胞胰酶消化，離心，重懸后種于6孔板。在細(xì)胞鋪滿皿底90%左右時(shí)加入西紅花苷溶液。實(shí)驗(yàn)分為5組，各組加入藥物西紅花苷的終濃度為0、200、300、400、500 μg/mL。48 h后，PBS洗滌，用不含EDTA胰酶消化細(xì)胞，離心，PBS洗滌2次后，按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作處理，依次加入染液及緩沖液，混勻，避光孵育10 min后，流式細(xì)胞儀檢測，CXP軟件分析結(jié)果。

1.2.4 PI標(biāo)記流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞周期 ?將指數(shù)期生長的細(xì)胞胰酶消化，離心，重懸后種于6 cm培養(yǎng)皿。在細(xì)胞鋪滿皿底80%左右時(shí)加入西紅花苷溶液。實(shí)驗(yàn)分為5組，各組加入藥物西紅花苷的終濃度為0、200、300、400、500 μg/mL。48 h后，用0.25%的胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，1000 r/min離心棄上清，1 mL PBS重懸細(xì)胞，再加10 μL Rase A，37°C水浴30 min后PBS洗滌2次，再加入50 μg/mL PI染色液500 μL，4°C下避光染色30 min后上機(jī)測試，采用周期分析軟件分析細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組間采用one-way ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定

經(jīng)消化、過濾、差速貼壁培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下用鼠抗人vimenin抗體鑒定呈棕色，cytokeratine抗體鑒定不呈色為間質(zhì)細(xì)胞，純度達(dá)95%以上（封三圖8）。

2.2 西紅花苷對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖作用的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示西紅花苷對(duì)子宮腺肌病異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，與藥物濃度及時(shí)間呈正比，隨著西紅花苷濃度的升高和作用時(shí)間的延長，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率也越高。從結(jié)果可以看到，濃度為400、500 μg/mL組處理細(xì)胞72 h后，增殖抑制率明顯高于濃度為200 μg/mL組。見表1。

2.3 西紅花苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

FITC-An-nexin V/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度西紅花苷對(duì)細(xì)胞有不同程度的誘導(dǎo)凋亡作用，隨著西紅花苷濃度的增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用越大。從結(jié)果可以看出，西紅花苷濃度為200、300、400、500 μg/mL組分別處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率依次為8.6%、20.7%、31.5%、40.9%，與西紅花苷 0 μg/mL組（1.9%）相比有顯著差異。見圖1。

2.4 西紅花苷對(duì)細(xì)胞周期影響

不同濃度的西紅花苷作用子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞48 h后，PI染色檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，隨著藥物濃度的升高，G0/G1期細(xì)胞所占比例逐漸增加，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期。見圖2。

3 討論

子宮腺肌病雖是良性疾病，主要特征是子宮內(nèi)膜在子宮肌層種植生長、浸潤、反復(fù)出血。但具有侵襲性生長、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等類似惡性腫瘤的生物學(xué)特性，臨床上對(duì)子宮腺肌病的治療目的在于縮減病灶，控制疼痛，促進(jìn)生育，減少復(fù)發(fā)[10]，目前尚無有效的保守治療方法。經(jīng)確診后多采用激素類藥物或手術(shù)治療，但激素治療副作用大，停藥后復(fù)發(fā)，而手術(shù)治療多有一定的適應(yīng)證，且保守性手術(shù)復(fù)發(fā)率都較高，常需切除子宮，創(chuàng)傷大，患者難以接受，二者均有一定的局限性。目前如何抑制子宮腺肌病灶的增長及轉(zhuǎn)移是臨床治療的難點(diǎn)。子宮腺肌病發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，現(xiàn)多認(rèn)為子宮腺肌病可能是一種多因素疾病，涉及相關(guān)學(xué)說很多，如經(jīng)血逆流學(xué)說[11]、體腔上皮化生學(xué)說[12]，但單一的學(xué)說均不能完全解釋清楚。子宮腺肌病的實(shí)質(zhì)是具有生物活性的子宮內(nèi)膜侵入肌層，因此內(nèi)膜細(xì)胞的特殊的生物學(xué)功能可能是腺肌病發(fā)生的機(jī)制之一。異位內(nèi)膜細(xì)胞粘附及侵襲能力增強(qiáng)[13，14]，增殖與凋亡異常[15，16]，免疫及相關(guān)炎癥因素等可能參與子宮腺肌病的發(fā)生與發(fā)展[17，18]。

黃歐平課題組前期研究發(fā)現(xiàn)來自臨床確診的子宮內(nèi)膜異位癥患者異位子宮內(nèi)膜組織中分離、鑒定的間質(zhì)細(xì)胞中DNMT3A的mRNA與蛋白表達(dá)都顯著下調(diào);間質(zhì)細(xì)胞中14-3-3ζ的mRNA及蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)一步的MSP結(jié)果顯示其基因啟動(dòng)子CpG島存在去甲基化狀態(tài);經(jīng)轉(zhuǎn)染DNMT3A重組腺病毒表達(dá)載體、DNMT3A高水平表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中細(xì)胞增殖率及遷移率減慢，細(xì)胞凋亡增加[8]，證明子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞異常至少是誘發(fā)子宮內(nèi)膜異位癥的主要原因之一，也很可能成為子宮內(nèi)膜異位癥治療的新靶點(diǎn)。

西紅花苷是從西紅花植物中提取的活性化合物，其生物活性包括抗炎、抗氧化、抗抑郁和抗癌作用。體外多項(xiàng)研究顯示西紅花苷通過炎癥及免疫信號(hào)通路發(fā)揮抗炎及抗腫瘤作用。西紅花苷在誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制其惡性增殖方面有顯著的療效。最近一項(xiàng)研究顯示西紅花通過miR-320/KLF5/HIF-1α信號(hào)傳導(dǎo)抑制胃癌細(xì)胞的EMT，遷移和侵襲[19]。Rania RM等[20]研究數(shù)據(jù)表明西紅花具有抗凋亡，抗炎和抗氧化活性，可能通過激活PI3K/Akt/mTOR軸和增強(qiáng)的miRNA-7和miRNA-221在魚藤酮（ROT）誘導(dǎo)的大鼠的帕金森病中顯示出有益的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果也表明，西紅花苷可以抑制子宮腺肌病間質(zhì)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，且藥物濃度越高，效果越顯著。

最新一項(xiàng)研究結(jié)果顯示西紅花通過降低炎癥因子如TNF-α、PGE2、IL-1β和IL-6及其基因表達(dá)（TNF-α、COX-2、IL）的水平，對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的敗血癥及其體外心臟毒性具有預(yù)防作用[21]。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究將西紅花和美沙拉嗪單獨(dú)和聯(lián)合治療潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模型，西紅花和美沙拉嗪通過抗氧化和抗炎作用對(duì)結(jié)腸組織產(chǎn)生保護(hù)作用[22]。在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)西紅花治療急性胰腺炎，調(diào)節(jié)胰腺炎性細(xì)胞因子，上調(diào)Nrf-2的表達(dá)，并下調(diào)了IL-6、TNF-α、硝基酪氨酸和NF-κB的表達(dá)，顯著降低胰腺水腫，血清淀粉酶和脂肪酶的水平[23]。免疫及炎癥因素也參與了子宮腺肌病的發(fā)病進(jìn)程，西紅花苷是否能夠參與調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞的免疫功能及炎癥因子，從而對(duì)子宮腺肌病起治療作用，非常值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)西紅花苷對(duì)子宮腺肌病中異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，與藥物濃度及時(shí)間呈正比，藥物濃度越高和作用時(shí)間越長抑制作用越明顯。雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)西紅花苷可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡，與藥物濃度成正比。不同濃度的西紅花苷作用子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明西紅花苷能抑制子宮腺肌病灶的生長及進(jìn)展。但具體的分子生物機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2020-03-02）