陳自洪 黃卡立

【摘要】目的：探討瘦素對人卵體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響。方法：選取2009年06月～ 2011年08月的在廣西人口和計劃生育研究中心就診的ICSI-BT周期的患者的不成熟卵母細胞共120枚。隨機分為4組，每組30枚，分別進行體外成熟培養(yǎng)，同時加入瘦素蛋白（美國Sigma公司產(chǎn)品），作用濃度分別為0、10、20、100 ng/ml，比較每組不成熟卵母細胞的成熟度、卵裂數(shù)、囊胚數(shù)以及受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率。結(jié)果：觀察瘦素對人未成熟卵母細胞體外成熟的影響發(fā)現(xiàn)，添加瘦素濃度為10 ng/ml的人卵母細胞成熟率（以極體排出率為指標(biāo)）及囊胚發(fā)育數(shù)明顯高于其他三組（P<0.05），而瘦素濃度為100與200 ng/ml時卵母細胞成熟率與囊胚發(fā)育數(shù)相差不大（P>0.05），各組卵裂數(shù)無明顯差異（P>0.05）;進一步了解瘦素對體外培養(yǎng)階段的影響發(fā)現(xiàn)，添加瘦素濃度為10 ng/ml的囊胚發(fā)育數(shù)最高，其次為100 ng/mL瘦素處理組，明顯高于其他兩組（P<0.05），各組卵裂數(shù)無明顯差異（P>0.05）。另外人瘦素蛋白有2個共同的強柔區(qū)、3個共同的表面可及性區(qū)、1個共同表面裸露區(qū)、1個共同的極性區(qū)，二級結(jié)構(gòu)中的α螺旋、伸鏈、Beta轉(zhuǎn)角、規(guī)則卷曲比例中，以α螺旋占比最高。結(jié)論：瘦素有利于人體獲得更多的成熟卵母細胞及優(yōu)質(zhì)胚胎，其中添加10 ng/mL瘦素能夠最大限度提高體外成熟率，效果最明顯。

【關(guān)鍵詞】人瘦素基因的克隆及在釀酒酵母中的表達和生物信息學(xué)分析

【中圖分類號】R-3 ? 【文獻標(biāo)識碼】A ? ?【文章編號】2107-2306（2020）03-005-02

人卵體外成熟是一種新的人類輔助生殖技術(shù)，應(yīng)用于人類不孕癥治療中具有深遠的影響。當(dāng)前，應(yīng)用卵母細胞IVM已成為當(dāng)前輔助生育技術(shù)的研究熱點。但這項技術(shù)目前尚不完善，需要對各種因素加以探討。本研究通過對不成熟卵母細胞在體外成熟培養(yǎng)中加入不同濃度的瘦素，觀察不成熟卵母細胞的發(fā)育、受精和卵裂情況，探討瘦素對人卵體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響，更深入地了解人類卵子和早期胚胎發(fā)育的機制，以獲得安全有效簡便的培養(yǎng)方法以及更多的成熟卵母細胞及優(yōu)質(zhì)胚胎。但目前國外關(guān)于不同濃度瘦素對人不成熟卵母細胞的影響的報道很少，我國尚無相關(guān)報道[1]。鑒于此，本研究選取了2009年06月～ 2011年08月的在廣西人口和計劃生育研究中心就診的ICSI-BT周期的患者的不成熟卵母細胞共120枚，進行體外成熟培養(yǎng)，同時加入不同濃度的瘦素蛋白，觀察其作用效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取2009年06月～ 2011年08月的在廣西人口和計劃生育研究中心就診的ICSI-BT周期的患者的不成熟卵母細胞共120枚。隨機分為4組，每組30枚，分別進行體外成熟培養(yǎng)，同時加入瘦素蛋白（美國Sigma公司產(chǎn)品），作用濃度分別為0、10、20、100 ng/ml，所有過程事先經(jīng)廣西人口和計劃生育研究中心生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會討論通過并經(jīng)患者雙方知情同意并簽字的情況下進行。

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞采集及體外成熟培養(yǎng)

觀察每組不成熟卵母細胞的成熟度，如發(fā)育為成熟卵母細胞，采用常規(guī)單精子卵漿內(nèi)注射（ICSI）法進行受精，ICSI后12～ 16h觀察受精情況，正常受精卵在含10%血清的P-1（Irvine公司，美國）培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)，每隔24h觀察胚胎發(fā)育情況，以卵裂速度正常、卵裂球均一或大致均一、低于10%碎片的胚胎判為優(yōu)質(zhì)胚胎。將卵丘-卵母細胞復(fù)合體置于成熟培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)（10～ 15枚/100μL/滴，微滴上覆蓋礦物油）。培養(yǎng)條件為37℃、5%C02、飽和濕度。成熟培養(yǎng)液中含促性腺激素、雌二醇等各種因子（成熟培養(yǎng)液配方國家專利受理號： 0211260819）。卵丘充分擴散后終止培養(yǎng)，0.1%透明質(zhì)酸酶消化，以排出第一極體判定為成熟卵母細胞。

1.2.2 卵母細胞成熟度評定

行ICSI 治療者體視顯微鏡下確定每份卵泡液對應(yīng)卵母細胞的成熟度。①成熟卵母細胞：卵丘松散，放射冠放射狀排列，可見透明帶和第一極體;②不成熟卵母細胞：卵丘緊密，放射冠緊包卵子，透明帶不清楚，無第一極體。

1.2.3 受精卵及胚胎觀察

加入精子12 ～16h后，體視顯微鏡下觀察卵子的受精情況。卵子受精標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)第二極體，卵細胞內(nèi)出現(xiàn)2個原核。取卵后第3天觀察胚胎發(fā)育 情況，根據(jù)卵裂球均勻程度和碎片多少，評價胚胎質(zhì)量：①1級胚胎，卵裂球大小均勻，無碎片;②級胚胎，卵裂球大小不均勻，碎片<10%;③級胚胎，卵裂球大小不均勻，碎片在10 %～50 %之間;④IV級胚胎，卵裂球大小不均勻，碎片> 50 %。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理[1]

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析處理，計數(shù)資料采用百分比表示，卡方檢驗;計量資料用（ ）表示，t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1瘦素對人未成熟卵母細胞體外成熟的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加瘦素濃度為10 ng/ml的人卵母細胞成熟率（以極體排出率為指標(biāo)）及囊胚發(fā)育數(shù)明顯高于其他三組（P<0.05），而瘦素濃度為100與200 ng/ml時卵母細胞成熟率與囊胚發(fā)育數(shù)相差不大（P>0.05），各組卵裂數(shù)無明顯差異（P>0.05），詳見表1。

2.2 瘦素對人卵母細胞體外受精后胚胎培養(yǎng)的影響

添加瘦素濃度為10 ng/ml的囊胚發(fā)育數(shù)最高，其次為100 ng/mL瘦素處理組，明顯高于其他兩組（P<0.05），各組卵裂數(shù)無明顯差異（P>0.05），詳見表2。

2.3 瘦素蛋白的強柔性區(qū)域、表面可及區(qū)域、表面裸露區(qū)域、極性區(qū)域

采用Bcepred軟件的Flexibility、Accessibility、Exposed Surface、Polarity分析蛋白質(zhì)的強柔性區(qū)域、表面可及區(qū)域、表面裸露區(qū)域、極性區(qū)域，如表2。

2.4 瘦素蛋白二級結(jié)構(gòu)

采用SOPMA程序分析瘦素蛋白二級結(jié)構(gòu)，使用Bcepred軟件的Turns選項分析瘦素蛋白的β轉(zhuǎn)角。從表4及圖1可看出，人的瘦素蛋白二級結(jié)構(gòu)的組成比例相似，且各阿爾法螺旋的位置相近或相同，提示功能相近。

3 討論

1939年P(guān)incus和Saunders證實人未成熟卵母細胞在體外能自發(fā)成熟，1969年Edwards進一步發(fā)現(xiàn)人體外成熟（ IVM）卵母細胞能完成體外受精。1991年Cha等利用IVM技術(shù)在世界上獲得了首例妊娠。從此IVM作為輔助生殖技術(shù)中的一項前沿技術(shù)，越來越多地被應(yīng)用于臨床，幫助一些卵子成熟障礙的患者獲得妊娠[2]。在IVP治療周期中卵子的發(fā)育不良和卵泡發(fā)育遲緩一直是一個困難的問題，通常這些周期有很高的取消率，發(fā)掘一種有效提高人卵母細胞體外成熟率的技術(shù)，對提高臨床妊娠率將起到至關(guān)重要的作用。

瘦素（leptin）是1994年被發(fā)現(xiàn)的一種蛋白激素，系16-KDa非糖基化多肽，含有46個氨基酸，是肥胖基因（Ob基因）的激素產(chǎn)物0b基因主要表達于脂肪組織，在下丘腦、垂體、骨骼肌、乳腺、性腺、胎盤等器官低水平表達。近年來不斷有研究提出，瘦素在鼠、人的卵和移植前胚胎中都有表達。鑒于此，本研究通過探討向成熟液添加不同濃度的瘦素對人卵體外成熟效果的影響，闡明瘦素對調(diào)控人卵體外成熟的作用。結(jié)果顯示：添加瘦素濃度為10 ng/ml的人卵母細胞成熟率（以極體排出率為指標(biāo)）及囊胚發(fā)育數(shù)最高，同時有助于激發(fā)體外受精后的胚胎發(fā)育潛能，提高體外受精囊胚發(fā)育率，其原因可能為瘦素能夠激活卵母細胞中磷酸二酯酶3B（PDE3B），從而降低卵母細胞中cAMP水平，啟動胚泡破裂，從而加速卵母細胞成熟。國外亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在排卵前的小樹卵泡培養(yǎng)環(huán)境里添加瘦素，可以增加后來的胚泡破裂比率[3]。

綜上所述，瘦素對人卵體外成熟的意義重大，其中以10 ng/ml瘦素處理濃度為最佳，不僅能提高體外成熟率，還能激發(fā)體外受精后的胚胎發(fā)育潛能，提高體外受精囊胚發(fā)育率，這項技術(shù)將對降低病患者的治療費用和副作用，造福不孕癥患者，起到積極的作用。

參考文獻

[1]陸陽清，羅茜，江明生等.瘦素對水牛卵母細胞體外成熟和體外受精胚胎發(fā)育的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，43（5）：697-700.

[2]易芳，刁莎，袁雪蓮等.血漿瘦素及可溶性瘦素受體與女性乳腺癌的相關(guān)性研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2018，52（3）：253-259.

[3]蔡恒，駱倩倩，張新澤等.下丘腦弓狀核瘦素/瘦素受體-吻素/吻素受體系統(tǒng)對大鼠卵泡發(fā)育的影響[J].解剖學(xué)雜志，2016，39（4）：397-400，408.

1.廣西壯族自治區(qū)計劃生育委員會科研課題，合同號：桂人口計生研0904

2.廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會自籌經(jīng)費科研課題，合同號：Z2016374

通訊作者：黃卡立，13607861107@sina.com