張 穎

(河北環(huán)境工程學(xué)院 生態(tài)學(xué)系，河北 秦皇島 066102)

菜籽油是我國(guó)主要食用油之一，主產(chǎn)于長(zhǎng)江流域及西南、西北等地。作為世界油料生產(chǎn)大國(guó)，2014—2018年我國(guó)油菜籽產(chǎn)量一直在1 300萬(wàn)t左右，約占全球油菜籽產(chǎn)量的19%，按出油率35%計(jì)，可制得菜籽油455萬(wàn)t[1]。菜籽油精煉產(chǎn)生的脫臭餾出物占毛油的0.4%～0.6%，據(jù)此估算我國(guó)每年菜籽油脫臭餾出物產(chǎn)量為1.82萬(wàn)～2.73萬(wàn)t[2]。菜籽油脫臭餾出物的主要成分為游離脂肪酸、磷脂、天然VE、植物甾醇、甘油酯等，是制備天然VE和植物甾醇的優(yōu)質(zhì)原料[3-5]。

以脫臭餾出物為原料制備天然VE的方法有皂化萃取法、酯化法、脲包法、超臨界萃取法、色譜法、硅膠吸附層析法和分子蒸餾法等[6-7]。目前，工業(yè)上常用的方法是酯化-分子蒸餾法，其原理是將脫臭餾出物中的游離脂肪酸和甘油酯分別與甲醇進(jìn)行酯化和酯交換反應(yīng)，得到沸點(diǎn)低的脂肪酸甲酯，通過(guò)蒸餾去除脂肪酸甲酯，再采用分子蒸餾對(duì)VE進(jìn)行富集。酯化和酯交換反應(yīng)按照催化劑的不同，有化學(xué)催化法、樹(shù)脂催化法以及酶催化法等。每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，且使用范圍各不相同。酶催化法具有反應(yīng)條件溫和、無(wú)廢水排放的優(yōu)點(diǎn)，具有較好的商業(yè)利用前景。

Lipase EC 3.1.1.3脂肪酶，又稱三?；视王；饷?，在水相體系中具有水解特性，在非水相體系中具有酯化、轉(zhuǎn)酯、胺解和醇解等特性[7-8]，本文利用該酶在非水相中的轉(zhuǎn)酯特性，研究其催化菜籽油脫臭餾出物中甘油酯酯交換反應(yīng)的工藝條件，以期為菜籽油脫臭餾出物提取VE提供參考。本研究在菜籽油脫臭餾出物游離脂肪酸與甲醇的酯化階段采用化學(xué)催化法，且基于脂肪酶成本高等因素，限定脂肪酶的用量為4%，在此基礎(chǔ)上考察影響酯交換反應(yīng)的主要因素，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化菜籽油脫臭餾出物酶法酯交換制備脂肪酸甲酯的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菜籽油脫臭餾出物(生育酚總含量為7.26%，其中α-生育酚相對(duì)含量為19.03%、δ-生育酚相對(duì)含量為12.75%；植物甾醇總含量為6.82%，其中菜籽甾醇1.22%、菜油甾醇2.14%、谷甾醇3.11%；酸價(jià)(KOH)95 mg/g)，秦皇島益海嘉里糧油食品有限公司；甲醇(純度99.9%)、氫氧化鉀、脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)以及其他分析試劑等。

Agilent 1260液相色譜，UIC-KDL5分子蒸餾，萬(wàn)分之一電子天平，電熱恒溫水浴鍋，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菜籽油脫臭餾出物的酯化反應(yīng)

取100 g菜籽油脫臭餾出物，加入30 g甲醇和3 g濃硫酸，加熱回流酯化反應(yīng)3 h，反應(yīng)完成后水洗至體系pH約為5.0，用作下一步反應(yīng)的原料。

1.2.2 酶催化酯交換反應(yīng)

調(diào)節(jié)1.2.1中酯化好的反應(yīng)體系的pH，然后加入一定量的甲醇、一定量的脂肪酶Lipase EC 3.1.1.3進(jìn)行酯交換反應(yīng)，反應(yīng)完成后將物料轉(zhuǎn)入分液漏斗進(jìn)行分離，分出下層甘油層，上層甲酯層首先進(jìn)行常壓蒸餾回收過(guò)量甲醇，然后離心分離得到脂肪酸甲酯。

1.2.3 酯交換轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

采用皂化-高碘酸氧化法測(cè)定原料以及產(chǎn)物中的甘油含量[9]，按下式計(jì)算酯交換轉(zhuǎn)化率。

酯交換轉(zhuǎn)化率=(原料中甘油含量-反應(yīng)后甲酯中甘油含量)/原料中甘油含量×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 甲醇用量對(duì)酯交換反應(yīng)的影響

甲醇對(duì)脂肪酶有一定的毒害作用，體系中過(guò)量的甲醇會(huì)對(duì)脂肪酶產(chǎn)生抑制作用，從而降低酯交換轉(zhuǎn)化率，因此本文采用兩步等量加入法來(lái)緩解甲醇對(duì)酶活的抑制作用，分別在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)和反應(yīng)中點(diǎn)時(shí)加入甲醇(下同)。在體系pH 7.0、反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時(shí)間20 h的條件下，分別加入菜籽油脫臭餾出物質(zhì)量10%、20%、30%、40%、50%的甲醇，考察甲醇用量對(duì)酯交換反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 甲醇用量對(duì)酯交換轉(zhuǎn)化率的影響

由圖1可見(jiàn)，隨著甲醇用量的增加酯交換轉(zhuǎn)化率逐漸升高，當(dāng)甲醇用量達(dá)到40%時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值，而進(jìn)一步加大甲醇用量，轉(zhuǎn)化率反而呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)，這可能與過(guò)量的甲醇導(dǎo)致部分酶失活有關(guān)。

2.1.2 體系pH對(duì)酯交換反應(yīng)的影響

酶制劑本身極易受到反應(yīng)體系pH的影響，考慮到菜籽油脫臭餾出物中天然VE在堿性條件下容易受到破壞，因而只考慮酯化后偏酸性(pH 5.0)的條件下，考察酯交換反應(yīng)體系pH對(duì)酯交換反應(yīng)的影響。用氫氧化鉀飽和溶液將體系pH分別調(diào)節(jié)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，在甲醇用量為菜籽油脫臭餾出物質(zhì)量的40%、反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時(shí)間20 h條件下，考察體系pH對(duì)酯交換反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 體系pH對(duì)酯交換轉(zhuǎn)化率的影響

由圖2可見(jiàn)，在體系pH由5.0上升到7.0的過(guò)程中，酯交換轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先上升后平緩的趨勢(shì)，體系pH為7.0時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值。因此，酶的適宜反應(yīng)體系pH接近中性。

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)酯交換反應(yīng)的影響

反應(yīng)溫度不僅是化學(xué)反應(yīng)過(guò)程的影響因素，也是酶活力的影響因素，考慮到酶本身受溫度的影響，本文在相對(duì)溫和的條件下進(jìn)行酯交換反應(yīng)。選取反應(yīng)溫度分別為40、45、50、55、60℃，在甲醇用量為菜籽油脫臭餾出物質(zhì)量的40%、體系pH 7.0、反應(yīng)時(shí)間20 h的條件下，考察反應(yīng)溫度對(duì)酯交換反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)酯交換轉(zhuǎn)化率的影響

由圖3可見(jiàn)，反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)進(jìn)程的影響較為顯著，在較低溫度下酯交換反應(yīng)比較緩慢，酯交換轉(zhuǎn)化率也較低，隨著反應(yīng)溫度的升高，轉(zhuǎn)化率明顯增加，但是反應(yīng)溫度進(jìn)一步升高后，轉(zhuǎn)化率呈下降態(tài)勢(shì)，這可能是因?yàn)檫^(guò)高的溫度影響了酶的活性，或者說(shuō)部分酶可能失活進(jìn)而降低了酯交換轉(zhuǎn)化率。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯交換反應(yīng)的影響

酶反應(yīng)條件比較溫和，相對(duì)于化學(xué)反應(yīng)而言，反應(yīng)時(shí)間有所延長(zhǎng)。選取反應(yīng)時(shí)間分別為4、8、12、16、20 h，在甲醇用量為菜籽油脫臭餾出物質(zhì)量的40%、體系pH 7.0、反應(yīng)溫度55℃的條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯交換反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯交換轉(zhuǎn)化率的影響

由圖4可見(jiàn)，隨著酯交換反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酯交換轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)逐漸升高后趨于平穩(wěn)的態(tài)勢(shì)?？紤]到工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，最佳反應(yīng)時(shí)間確定為16 h。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考慮到反應(yīng)時(shí)間的影響不大，且為保證反應(yīng)充分，將反應(yīng)時(shí)間確定為16 h，選取甲醇用量、體系pH、反應(yīng)溫度3個(gè)因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化反應(yīng)條件。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，正交實(shí)驗(yàn)方差分析見(jiàn)3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

由表2可見(jiàn)，各因素對(duì)酶法酯交換轉(zhuǎn)化率的影響大小為甲醇用量>反應(yīng)溫度>體系pH。由表3可見(jiàn)，甲醇用量和反應(yīng)溫度為顯著影響因素。酶法酯交換的最佳因素水平組合為A3B3C2，即甲醇用量45%、體系pH 7.0，反應(yīng)溫度55℃。在最佳條件下，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到酶法酯交換平均轉(zhuǎn)化率為85.35%。

3 結(jié) 論

以脂肪酶催化菜籽油脫臭餾出物的甘油酯進(jìn)行酯交換反應(yīng)制備脂肪酸甲酯，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在適量甲醇用量(45%)、接近中性(pH 7.0)的反應(yīng)體系、反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時(shí)間16 h的條件下，可以使酯交換轉(zhuǎn)化率達(dá)到85.35%，得到了較好的轉(zhuǎn)化率。

相對(duì)于傳統(tǒng)化學(xué)催化法而言，酶法具有降低廢水排放、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢(shì)，但是由于液體脂肪酶不可重復(fù)使用，導(dǎo)致生產(chǎn)成本相對(duì)化學(xué)催化法而言較高，同時(shí)酶失活產(chǎn)物可能對(duì)后續(xù)的甾醇結(jié)晶工段造成一定影響。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，還可以根據(jù)物料的特性進(jìn)一步對(duì)反應(yīng)體系的適應(yīng)性、反應(yīng)時(shí)間的精確性、脂肪酶用量以及生物活性提升等方面進(jìn)行深入研究，以更好地降低生產(chǎn)成本和提高效能。由于酶法避免了傳統(tǒng)化學(xué)法酸堿產(chǎn)生的廢水等問(wèn)題，為實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)提供了新的途徑，具有較好的商業(yè)推廣應(yīng)用價(jià)值。