溫針灸對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠局部穴區(qū)組織代謝的影響

曹佳男，鐘 歡，劉 密，2，羅曉婷，王英姿，常小榮*，馮 芳*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.瀏陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 瀏陽(yáng)410300；3.郴州市第一人民醫(yī)院西院，湖南 郴州423000）

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis， CAG）是臨床上一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病，其主要病理特征為胃黏膜固有腺體萎縮、數(shù)目減少，胃黏膜變薄，黏膜基層增厚等。CAG 基礎(chǔ)上伴有腸腺化生或胃黏膜異型增生等病理表現(xiàn)的已經(jīng)被歸為胃癌的癌前病變狀態(tài)，且有報(bào)道證實(shí)CAG 患者發(fā)生胃癌的風(fēng)險(xiǎn)偏高[1-2]。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[3]，臨床證據(jù)顯示針灸治療CAG的效果明顯，主要包括針刺、艾灸、針刺-艾灸相結(jié)合、電針等療法。 課題組前期研究[4-7]證實(shí)針刺與艾灸對(duì)胃黏膜具有保護(hù)作用，且從代謝角度證實(shí)，不同干預(yù)手段下機(jī)體的代謝產(chǎn)物有差異，從而治療疾病。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后的一種新興學(xué)科，是對(duì)生物體或者組織內(nèi)的代謝物進(jìn)行定量分析，并通過(guò)代謝物的差異分析代謝物與生理病理相對(duì)關(guān)系的一種技術(shù)[8]。 同時(shí)也可反映機(jī)體在整體環(huán)境下因不同干預(yù)方式引起代謝變化產(chǎn)生紊亂功能等。 這一特性與中醫(yī)學(xué)治療疾病的“整體思維”有著異曲同工之妙，提示代謝組學(xué)層面分析疾病狀態(tài)，可能有助于為中醫(yī)治療疾病提供循證依據(jù)[9-10]。本課題組前期有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[6]，針刺與艾灸分別對(duì)CAG大鼠胃組織、局部穴區(qū)組織代謝有著不同的影響，但對(duì)于將針刺與艾灸結(jié)合的溫針灸療法的相關(guān)論述目前暫缺乏考證。 溫針灸屬于中醫(yī)外治療法的一種，它是將針刺與艾灸有機(jī)結(jié)合起來(lái)，既有作用于穴位的刺激又有艾灸的灸熱刺激，共同起到活血化瘀、溫經(jīng)通絡(luò)的作用。 陳智昌等[11]采用穴位埋線(xiàn)聯(lián)合溫針灸治療CAG 的臨床研究證實(shí)穴位埋線(xiàn)聯(lián)合溫針灸可有效改善臨床癥狀，且可修復(fù)胃黏膜，但對(duì)于作用機(jī)制尚不明確。 隨著課題組研究的逐漸深入，對(duì)溫針灸對(duì)于治療CAG 的具體機(jī)制存在疑問(wèn)。由此本文將立足于代謝組學(xué)技術(shù)，觀(guān)察溫針灸對(duì)CAG 大鼠的治療作用，并分析對(duì)大鼠局部組織代謝物差異，以期為其臨床深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

42 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20） g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SYXK（湘）2013-0005。 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將大鼠分為正常組、模型組、模型+溫針灸組，每組14 只。每組分籠飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理符合2006 年中華人民共和國(guó)科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器

N 甲基-N'-硝基-N 亞硝基胍（N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine， MNNG，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社，75F7I-TF）；蘇木素-伊紅（Wellbio）；BA110S 萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；TGL16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀有限公司）；組織病理包埋儀(德國(guó)Leica 公司)；核磁共振儀Bruker AVANCE III HD 850 MHz（德國(guó)Bruker公司）。

1.3 模型制備

參考相關(guān)文獻(xiàn)并加以改進(jìn)[12-13]，42 只SPF 級(jí)SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，分別采用MNNG 癌誘變劑、不規(guī)律進(jìn)食以及40%無(wú)水乙醇灌胃制備CAG 大鼠模型：配制150 μg/mL MNNG 液體裝于包裹著錫箔紙的飲水瓶中，供各模型組大鼠飲用，并以第1 天足量飲食第2 天禁食為1 個(gè)循環(huán)，如此反復(fù)來(lái)制造不規(guī)律進(jìn)食的模型。 此外，各模型組大鼠用40%的乙醇灌胃，每周2 次，間隔2～3 d 以模仿長(zhǎng)期飲酒習(xí)慣，連續(xù)處理12 周。

第12 周每組大鼠隨機(jī)各取2 只處死，取胃組織，經(jīng)過(guò)甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀(guān)察胃黏膜組織有無(wú)出現(xiàn)固有腺體萎縮，判斷造模成功與否[14]。

1.4 干預(yù)方法

腧穴選擇：中脘穴，足三里穴（雙），穴位定位參考實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[15]。

溫針灸方法：消毒大鼠針刺穴位部位，將華佗牌一次性針灸針0.18 mm×25 mm 不銹鋼毫針刺入所選穴位上，直刺深度為5 mm，留針20 min，將規(guī)格為5.3 mm×85 mm 的細(xì)支艾炷（湖南高圣生物有限公司）裁剪為5.3 mm×15 mm 的艾柱，置于針灸針上，點(diǎn)燃，1 次/d，持續(xù)治療14 d。

1.5 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

胃組織病理學(xué)觀(guān)察[4]：分別在模型評(píng)價(jià)時(shí)以及治療后觀(guān)察大鼠胃組織變化。 HE 染色：每次取材前需將大鼠禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后剖腹，鈍性分離胃體，剪開(kāi)胃部，PBS 沖洗，在出現(xiàn)明顯病變處剪取胃組織標(biāo)本，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片、HE 染色，400 倍光鏡下觀(guān)察標(biāo)本病理變化。

代謝組學(xué)檢測(cè)局部穴區(qū)組織的采集及樣本制備：大鼠麻醉后以足三里為中心，5 mm×5 mm×5 mm的體積摘取大鼠局部穴區(qū)組織，液氮淬滅并保存在-80 ℃冰箱中。在處理樣品前，提前在-20 ℃冰箱中預(yù)冷，再?gòu)?80 ℃冰箱中取出穴區(qū)組織樣本，稱(chēng)重，取（100±50） mg 的穴區(qū)組織。 在0 ℃條件下，按照4 mL/g 的比例加入甲醇、氯仿，2.85 mL/g 的比例加入雙蒸水勻漿、離心。 取上層清液（水相0.5 mL）轉(zhuǎn)移到新的離心管中，經(jīng)氮吹儀濃縮去甲醇，冷凍干燥后溶于PBS 液中，并將上層清液550 μL 轉(zhuǎn)移到新的核磁管中，離心待檢測(cè)（1 000 r/min，5 min）4 ℃保存待檢測(cè)。

使用核磁共振儀Bruker Avance ⅢNMR 譜儀（850 MHz），使用1Dnoesygppr1d 譜脈沖序列（Bruker-Biospin pulse program library）采集1H-NMR。 實(shí)驗(yàn)參數(shù)：實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃，采樣點(diǎn)數(shù)（TD）為65 536，混合時(shí)間（τm）為120 ms，譜寬（SWH）16 ppm，弛豫延遲時(shí)間（D1）4 s，混合時(shí)間（D8）0.01 s，采樣時(shí)間（AQ）3.27 s，累加次數(shù)NS=128 次，空掃次數(shù)DS=4次。 用Chenomx NMR Suit 軟件（Chenomx Inc.，Edmonton， Canada）結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及BMRB（http://www.bmrb.wisc.edu/metabolomics/）、HMDB（http://www.hmdb.ca/）等化合物化學(xué)位移數(shù)據(jù)庫(kù)，指認(rèn)代謝物的共振信號(hào)，并挑選代表性樣品，采用COSY、TOCSY、J-resolved 等2D NMR 譜認(rèn)代謝物的指認(rèn)。 使用MestReNova 6.1 處理1H-NMR 譜。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)算機(jī)采集1H-NMR 氫譜圖，并對(duì)代謝物譜峰進(jìn)行積分，通過(guò)主成分分析（PCA 分析）、偏最小二乘法（PLS-DA）分析，對(duì)個(gè)組大鼠代謝模式識(shí)別，結(jié)合正交偏最小二乘法（OPLS-DA）對(duì)差異物進(jìn)行篩選。最后統(tǒng)計(jì)以變量的重要性值＞1 且滿(mǎn)足P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 胃組織病理學(xué)檢查

各模型組大鼠胃組織較正常組相比，組織黏膜層變薄，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，組織充血、水腫，腺體結(jié)構(gòu)排列紊亂，以上符合CAG 病理診斷。治療2 周后，同模型組相比，模型+溫針灸組表現(xiàn)為固有腺體保持相對(duì)較完整，黏膜下有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠胃組織HE 染色圖（×400）

2.2 CAG 大鼠“足三里”穴區(qū)組織代謝的變化

PCA 分析對(duì)比正常組與模型組，二者代謝模式能夠較好區(qū)分，提示模型組大鼠局部穴區(qū)組織代謝模式發(fā)生了變化（圖2A）。 再將兩組結(jié)果進(jìn)行PLSDA 建模，結(jié)果表明兩組樣本也可以被正確區(qū)分，且交叉驗(yàn)證模型可靠（圖2B-2C）。 由于進(jìn)行CAG大鼠“足三里”局部穴區(qū)組織差異性代謝物分析之前需要進(jìn)行OPLS-DA，結(jié)果分析表明正常組與模型組大鼠穴區(qū)組織代謝模式在第一預(yù)測(cè)主成分上可以很好區(qū)分（圖2D）。 OPLS-DA 維載荷圖表明，相對(duì)于正常組，模型組穴區(qū)組織中谷氨酰胺（Gln）、琥珀酸（Suc）、賴(lài)氨酸（Lys）、富馬酸（Fum）、次黃嘌呤（HX）、一磷酸腺苷（Amp）顯著降低；N-乙酰天門(mén)冬氨酸（NAA）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、磷酸膽堿/甘 磷 酸 膽 堿（PC/GPC）、酪 氨 酸（Tyr）、苯 丙 氨 酸（Phe）、黃嘌呤（Xan）、肌苷（Ino）顯著升高（圖2E）。

2.3 溫針灸對(duì)CAG 大鼠局部穴區(qū)組織代謝的影響

如圖3A 所示，模型組與模型+溫針灸組對(duì)比，顯示模型+溫針灸組有兩個(gè)樣本與模型組重疊，但整體區(qū)分趨勢(shì)清晰；隨后對(duì)兩組進(jìn)行PLS-DA 建模，如圖3B 所示，兩組樣本明顯區(qū)分，且交叉驗(yàn)證（圖3C）表明模型可靠。 OPLS-DA 得分（圖3D）結(jié)果表明，兩組大鼠穴區(qū)組織代謝模式在第一預(yù)測(cè)主成分上可以很好區(qū)分可以。 而維載荷圖中，模型+溫針灸組大鼠穴區(qū)組織產(chǎn)生的差異性代謝物為乳酸（Lac）、N，N-二甲基甘氨酸（DMG）、肌醇（m-I）、一磷酸腺苷（AMP）、腺苷（Ade）、次黃嘌呤（HX）顯著升高，而B(niǎo)et、蘇氨酸（Thr）、磷酸膽堿（PC）、甘磷酸膽堿（GPC）、二磷酸腺苷（ADP）、肌苷（Ino）顯著降低（圖3E）。

圖2 正常組和模型組大鼠穴區(qū)組織代謝模式圖

3 討論

代謝組學(xué)是一種兼顧檢測(cè)和評(píng)估由于疾病或其他刺激方式引起生物體機(jī)體內(nèi)源性代謝成分變化的技術(shù)[16]，通過(guò)檢測(cè)代謝物的變化進(jìn)行代謝譜分析檢測(cè)和診斷生物標(biāo)志物來(lái)了解人體整個(gè)生命過(guò)程中發(fā)生的改變[17-18]。 本實(shí)驗(yàn)基于代謝組學(xué)技術(shù)從代謝物層面分析總結(jié)當(dāng)機(jī)體在接受到相應(yīng)刺激時(shí)，代謝模式發(fā)生的變化、出現(xiàn)的差異性代謝物以及各代謝物之間變化的相關(guān)性。

同正常組大鼠相比，模型組大鼠局部穴區(qū)組織有14 個(gè)差異性代謝物。 其中濃度降低的代謝物有：谷氨酰胺、琥珀酸、賴(lài)氨酸、富馬酸、次黃嘌呤、一磷酸腺苷，升高的代謝物：N-乙酰天門(mén)冬氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、磷酸膽堿/甘磷酸膽堿、酪氨酸、苯丙氨酸、黃嘌呤、肌苷。谷氨酰胺分解產(chǎn)生的谷氨酸可通過(guò)增加一氧化氮生成、超氧化物歧化等一系列反應(yīng)減少黏膜損傷[19]，谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的代謝為腸道完整性和功能維持提供大量的三磷酸腺苷[20]，參與能量代謝與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[21]。以上提示CAG 病理狀態(tài)下大鼠局部穴區(qū)組織的能量代謝出現(xiàn)紊亂。

圖3 模型組和模型+溫針灸組大鼠穴區(qū)組織代謝模式圖

同模型組相比，溫針灸干預(yù)后，大鼠“足三里”局部穴區(qū)組織的代謝發(fā)生了改變：甜菜堿、蘇氨酸、磷酸膽堿、甘磷酸膽堿、二磷酸腺苷、肌苷含量降低；乳酸、N，N-二甲基甘氨酸、肌醇、一磷酸腺苷、腺苷、次黃嘌呤的含量有所升高。一磷酸腺苷是一種腺嘌呤核糖核苷酸，由三磷酸腺苷兩次水解得到，在能量代謝上起著重要作用。 而腺苷是用于合成三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸等重要的中間體，在溫針灸干預(yù)后磷酸腺苷、腺苷含量回調(diào)，提示溫針灸可以增加局部組織的能量代謝。 次黃嘌呤是核酸代謝的產(chǎn)物，在次黃嘌呤氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化成黃嘌呤，溫針灸回調(diào)次黃嘌呤的含量同樣證實(shí)溫針灸可增強(qiáng)CAG大鼠機(jī)體的核酸代謝[22]。以上分析提示，溫針灸干預(yù)主要調(diào)節(jié)CAG 大鼠穴區(qū)組織的核酸代謝及能量代謝方面。

綜上所述，溫針灸可調(diào)節(jié)CAG 大鼠局部穴區(qū)組織代謝物的含量。雖然目前代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到中醫(yī)各領(lǐng)域，但由于代謝組學(xué)技術(shù)的特性，其后期數(shù)據(jù)挖掘較復(fù)雜且困難，準(zhǔn)確尋找作用機(jī)制還需深入研究，以期為臨床選擇治療方法提供強(qiáng)有力的依據(jù)，從而進(jìn)一步提高針灸治療疾病的臨床療效。