王麗純 舒寶童 馬宇 劉意

視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷可引發(fā)視神經(jīng)功能障礙。缺血性腦出血、糖尿病、缺氧等誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可促使視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致視功能喪失[1]。因此，基于視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制尋找相關(guān)分子標(biāo)志物有助于防治視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷。長(zhǎng)鏈非編碼RNA-X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物(long non-coding RNA X-inactive specific transcript，lncRNA XIST)屬于內(nèi)源性非編碼RNA，可促進(jìn)神經(jīng)元凋亡[2]。XIST高表達(dá)可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[3]，XIST還可調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡[4]。但XIST在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷中的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。靶基因預(yù)測(cè)軟件starBase預(yù)測(cè)顯示，微小RNA-410(microRNA-410，miR-410)可能是XIST的靶基因。研究表明，缺血性腦卒中患者中miR-410過表達(dá)對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用[5]。相關(guān)報(bào)道指出，核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf-2)信號(hào)通路激活可發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用從而減輕組織損傷[6]。但XIST是否通過調(diào)控miR-410及Nrf-2信號(hào)通路而影響視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷尚未可知。谷氨酸(glutamic acid，Glu)屬于視網(wǎng)膜興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，可促使神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，還可促使視網(wǎng)膜缺血、缺氧及糖尿病視網(wǎng)膜病變等視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷及凋亡[7]。因此，本研究采用Glu誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討沉默XIST對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，分析其對(duì)miR-410的調(diào)控作用，初步探究其可能作用機(jī)制，為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)及相關(guān)疾病藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級(jí)健康SD小鼠10只， 3～5 d 齡，購(gòu)自上海凱學(xué)生物科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(滬)：2016-0008。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Glu購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；lncRNA XIST小干擾RNA(si-lncRNA XIST)、亂序無意義陰性序列(si-con)、miR-410模擬物(mimics)、陰性對(duì)照(miR-con)、miR-410特異性寡核苷酸抑制劑 (anti-miR-410)、陰性對(duì)照(anti-miR-con)均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞核蛋白提取試劑盒與總蛋白提取試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；兔抗鼠活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Cleaved Caspase-9)抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗鼠Nrf-2、NADH 脫氫酶 1(NQO1)、血紅素氧合酶 1(HO-1)抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞參照文獻(xiàn)[8]原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，具體步驟為：頸椎脫臼法處死小鼠，取眼球后去除角膜、晶狀體及玻璃體，分離出視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，剪碎，用12.5 g·L-1胰蛋白酶與2 g·L-1透明質(zhì)酸酶(11)消化，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化20 min，使用加含有體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，4 ℃條件下800 r·min-1離心5 min，棄上清，加入含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液，用200目無菌篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為100個(gè)·mL-1，按每孔150 μL接種于24孔板，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，加入阿糖胞苷(10 mg·L-1)，每隔3 d更換一次培養(yǎng)液。

1.2.2 Glu處理及實(shí)驗(yàn)分組收集培養(yǎng)7 d的原代小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，參照文獻(xiàn)[9]選用20 μmol·L-1的Glu分別處理視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞0 h、6 h、12 h、24 h、48 h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，篩選Glu適宜作用時(shí)間用于后續(xù)研究。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，加入20 μmol·L-1的Glu處理24 h，記作Glu組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC組。將si-con、si-lncRNA XIST、pcDNA和pcDNA-lncRNA XIST轉(zhuǎn)染至視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，分別記作si-con組、si-lncRNA XIST組、pcDNA組和pcDNA-lncRNA XIST組；將si-con、si-lncRNA XIST、miR-con、miR-410 mimics、si-lncRNA XIST與anti-miR-con、si-lncRNA XIST與anti-miR-410轉(zhuǎn)染至視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，隨后使用20 μmol·L-1的Glu處理24 h，分別記作Glu+si-con組、Glu+si-lncRNA XIST組、Glu+miR-con組、Glu+miR-410組、Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-con組、Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-410組。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)9次或每組設(shè)9個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 檢測(cè)LDH活性收集各組細(xì)胞，根據(jù)LDH活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組LDH活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集各組細(xì)胞，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至 10×103個(gè)·mL-1，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，4 ℃條件下經(jīng)1000 r·min-1離心5 min(離心半徑6 cm)，收集細(xì)胞沉淀至流式管內(nèi)，加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC，混勻，加入5 μL PI，混勻，室溫避光孵育20 min，置于FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)XIST、miR-410表達(dá)參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后收集各組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。XIST正向引物：5’-CAGACGTGTGCTCTTC-3’，反向引物：5’-CGATCTGTAAGTCCACCA-3’；β-actin正向引物：5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’，反向引物：5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’；miR-410正向引物：5’-TAACACTGTCTGGTAACGATGT-3’，反向引物：5’-CATCTTACCGGACAGTGCTGGA-3’；U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，ddH2O 6.0 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。XIST以β-actin為內(nèi)參，miR-410以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算XIST、miR-410相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)lncRNA XIST與miR-410的靶向調(diào)控關(guān)系靶基因預(yù)測(cè)軟件starBase預(yù)測(cè)顯示，lncRNA XIST的序列中含有與miR-410互補(bǔ)的核苷酸序列，將結(jié)合位點(diǎn)序列插入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建野生型報(bào)告基因載體WT-lncRNA XIST，利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，同時(shí)將突變的結(jié)合位點(diǎn)插入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建突變型報(bào)告基因載體MUT-lncRNA XIST，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，分別將WT-lncRNA XIST、MUT-lncRNA XIST與miR-con、miR-410 mimics共轉(zhuǎn)染至視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，分別命名為miR-con組與miR-410組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測(cè)各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot檢測(cè)收集各組細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞核蛋白與總蛋白提取試劑盒分別提取細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度， SDS-PAGE分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫條件下采用50 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Cleaved Caspase-3(1800)、Cleaved Caspase-9(1800)、Nrf-2(1500)、HO-1(1500)、NQO1(1500)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(13000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 Glu誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡的影響隨著Glu誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達(dá)水平均顯著升高(均為P<0.01)，LDH活性顯著升高(P<0.01)，其中Glu誘導(dǎo)24 h、48 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(均為P<0.05)，而Glu誘導(dǎo)24 h與48 h之間作用效果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，因而后續(xù)研究使用的Glu誘導(dǎo)時(shí)間為24 h(見圖1、表1)。

圖1 Western blot檢測(cè)Glu誘導(dǎo)不同時(shí)間視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)

表1 Glu誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞LDH活性、細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

2.2 Glu誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞lncRNA XIST和miR-410表達(dá)的影響隨著Glu誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA XIST的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，miR-410的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，其中Glu誘導(dǎo)24 h、48 h時(shí)顯著差異于其他時(shí)間點(diǎn)(均為P<0.05)，而Glu誘導(dǎo)24 h與48 h之間表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(見表2)。

表2 Glu誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞lncRNA XIST和miR-410表達(dá)的影響

2.3 沉默lncRNA XIST抑制Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡與NC組比較，Glu組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、LDH活性及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);與Glu+si-con組比較，Glu+si-lncRNA XIST組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、LDH活性及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見圖2和表3)。

圖2 Western blot檢測(cè)NC組、Glu組、Glu+si-con組、Glu+si-lncRNA XIST組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)

表3 沉默lncRNA XIST對(duì)Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞LDH活性、細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響 )

2.4 lncRNA XIST靶向調(diào)控miR-410的表達(dá)靶基因預(yù)測(cè)軟件starBase預(yù)測(cè)顯示，lncRNA XIST與miR-410存在互補(bǔ)序列(見圖3)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型報(bào)告基因載體WT-lncRNA XIST的細(xì)胞中，miR-410組熒光素酶活性為0.54±0.06，顯著低于miR-con組的1.00±0.09(P<0.05)；轉(zhuǎn)染突變型報(bào)告基因載體MUT-lncRNA XIST的細(xì)胞中，miR-410組(1.23±0.14)與miR-con組(1.19±0.11)熒光素酶活性相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-con組(1.03±0.11)相比，si-lncRNA XIST組(4.28±0.49)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中miR-410的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與pcDNA組(0.98±0.12)相比，pcDNA-lncRNA XIST組(0.54±0.08)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中miR-410的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖3 lncRNA XIST與miR-410存在互補(bǔ)序列

2.5 過表達(dá)miR-410抑制Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡與Glu+miR-con組比較，Glu+miR-410組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、LDH活性及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)(見圖4和表4)。

圖4 Western blot檢測(cè)Glu+miR-con組和Glu+miR-410組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)

表4 轉(zhuǎn)染miR-410對(duì)Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞LDH活性、細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

2.6 干擾miR-410部分逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA XIST抑制的Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡相較于Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-con組，Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-410組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、LDH活性及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)(見圖5和表5)。

圖5 Western blot檢測(cè)Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-con組和Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-410組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)

表5 轉(zhuǎn)染anti-miR-410部分逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA XIST對(duì)Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞LDH活性、細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響 )

2.7 lncRNA XIST對(duì)Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞Nrf-2信號(hào)通路的影響與NC組相比，Glu組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Nrf-2、HO-1、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；與Glu+si-con組相比，Glu+si-lncRNA XIST組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Nrf-2、HO-1、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；與 Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-con組相比，Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-410組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Nrf-2、HO-1、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見圖6和表6)。

圖6 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Nrf-2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)

表6 lncRNA XIST對(duì)Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞Nrf-2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

lncRNA可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA從而參與視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展過程。研究表明，miRNA在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中異常表達(dá)并可能參與缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變的發(fā)生過程[10-12]。因而，積極探尋新型分子標(biāo)志物可為視網(wǎng)膜損傷治療藥物的研發(fā)提供新思路。

本研究結(jié)果顯示，Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和LDH活性顯著升高。研究表明，沉默lncRNA XIST可通過調(diào)節(jié)miR-449抑制急性心肌梗死大鼠的心肌細(xì)胞凋亡[13]。急性肺炎時(shí)抑制XIST可通過靶向miR-370-3p/TLR4而減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的WI-38細(xì)胞凋亡及炎癥損傷[14]。本研究結(jié)果與鮑月寧等[15]研究結(jié)果相似，提示成功構(gòu)建視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA XIST的表達(dá)水平顯著升高，沉默lncRNA XIST后視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低，LDH活性顯著降低，提示沉默lncRNA XIST可抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡及減輕炎癥損傷。本研究結(jié)果顯示，沉默lncRNA XIST后視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達(dá)水平顯著降低，與馬偉等[16]研究結(jié)果相似，提示沉默lncRNA XIST可能通過下調(diào)Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達(dá)而抑制線粒體途徑活化，進(jìn)而抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)與qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，lncRNA XIST可靶向結(jié)合miR-410并可抑制miR-410的表達(dá)。miR-410通過PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)大鼠的七氟醚麻醉誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[17]。miR-410通過抑制PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路，在6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[18]。本研究結(jié)果顯示，Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中miR-410的表達(dá)水平明顯降低，miR-410過表達(dá)后視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和LDH活性顯著降低，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量也均明顯降低，提示miR-410過表達(dá)可抑制Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡及減輕氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果還顯示，干擾miR-410表達(dá)聯(lián)合沉默lncRNA XIST處理后，Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯升高，LDH活性明顯增強(qiáng)，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，提示沉默lncRNA XIST可能通過上調(diào)miR-410的表達(dá)從而減輕Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷。

Nrf-2信號(hào)通路是一種抗氧化通路，正常生理?xiàng)l件下，Nrf-2位于細(xì)胞質(zhì)且與Keap1蛋白結(jié)合；當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)Nrf-2與Keap1分離，Nrf-2進(jìn)入細(xì)胞核并激活下游HO-1、NQO1，從而增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力[19-20]。本研究結(jié)果顯示，Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Nrf-2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)水平均顯著降低，說明Glu可抑制Nrf-2信號(hào)通路激活；沉默lncRNA XIST后Nrf-2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)水平均顯著升高，而干擾miR-410后Nrf-2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示沉默lncRNA XIST可能通過上調(diào)miR-410表達(dá)而激活Nrf-2信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。

綜上所述，lncRNA XIST在Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中呈高表達(dá)，而miR-410表達(dá)下調(diào)，沉默lncRNA XIST可能通過上調(diào)miR-410的表達(dá)從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡及減輕細(xì)胞損傷，且其可能是通過激活Nrf-2信號(hào)通路而發(fā)揮作用的。本研究結(jié)果可為缺血缺氧性視網(wǎng)膜疾病的防治提供新方向。