孫 杰

(上海城投水務(wù)〈集團(tuán)〉有限公司，上海 200082)

酶底物法(defined substrate technology，DST)是指在選擇性培養(yǎng)基上能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)的細(xì)菌群組分解色原底物、釋放色原體，使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，來(lái)檢測(cè)水中大腸菌群的方法[1]。與傳統(tǒng)多管發(fā)酵法相比，該方法具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短、無(wú)需確認(rèn)試驗(yàn)、無(wú)菌要求低等優(yōu)點(diǎn)，且大量文獻(xiàn)證實(shí)，Colilert酶底物法試劑與多管發(fā)酵法在檢測(cè)大腸菌群結(jié)果上沒(méi)有顯著性差異[2-3]。因此，該方法被廣泛應(yīng)用于大腸菌群的檢測(cè)[4-6]?！渡铒嬘盟畼?biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》(GB/T 5750.12—2006)[1]和《水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測(cè)定》(HJ 1001—2018)[7]中，均將酶底物法作為總大腸菌群和大腸埃希氏菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。隨著酶底物法應(yīng)用的普及，市面上出現(xiàn)了各種不同品牌的酶底物法試劑，這些產(chǎn)品的質(zhì)量良莠不齊，性能也不同，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為確定酶底物法試劑的性能，保證檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)有效，本文對(duì)市面上常見(jiàn)的3種酶底物法試劑進(jìn)行了分析比較，檢測(cè)定量質(zhì)控、原水、二次供水、管網(wǎng)水等多種水樣，并對(duì)其性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要試劑、設(shè)備

3種酶底物商品試劑(Colilert、LI、QT)，程控定量封口機(jī)、無(wú)菌取樣瓶、97孔定量盤(pán)、51孔定量盤(pán)、NSI定量質(zhì)控菌株。試驗(yàn)使用國(guó)產(chǎn)恒溫培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z型)，溫控精度為±0.5 ℃，經(jīng)計(jì)量部門(mén)校準(zhǔn)合格。

1.2 試驗(yàn)步驟

(1)水樣采集：原水水樣為上海某水廠的進(jìn)廠原水，二次供水水樣為上海居民的龍頭水，管網(wǎng)水水樣取自上海某地區(qū)的管網(wǎng)監(jiān)測(cè)點(diǎn)。參照GB/T 5750.2—2006進(jìn)行采集和樣品保存[8]，采樣容器使用一次性無(wú)菌含硫代硫酸鈉采樣瓶。水樣采集后冷藏保存，并在4 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

(2)定量質(zhì)控檢測(cè)：NSI定量質(zhì)控菌株從-10 ℃冰箱中取出，平衡溫度10～15 min后，將質(zhì)控菌株轉(zhuǎn)移入預(yù)先準(zhǔn)備好的100 mL無(wú)菌磷酸緩沖液中，輕輕振蕩，待全部溶解后在30 min內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

(3)樣品檢測(cè)：樣品使用酶底物法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)項(xiàng)目為總大腸菌群、大腸埃希氏菌。檢測(cè)步驟參照GB/T 5750.12—2006。

(4)實(shí)際水樣陽(yáng)性結(jié)果測(cè)序：對(duì)于定量盤(pán)陽(yáng)性結(jié)果，送由金唯智生物科技有限公司測(cè)序，對(duì)菌種進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果分析

2.1 混合質(zhì)控陽(yáng)性菌：飲用水和環(huán)境水定量質(zhì)控檢測(cè)

Colilert、LI、QT總大腸菌群和大腸埃希氏菌質(zhì)控檢測(cè)結(jié)果表明：3種試劑的檢測(cè)結(jié)果均在質(zhì)控樣品結(jié)果可接受范圍內(nèi)；QT試劑總大腸菌群和大腸埃希氏菌結(jié)果相同，表明該試劑對(duì)大腸埃希氏菌的顯色反應(yīng)有誤，未能區(qū)分大腸埃希氏菌和其他混合菌種。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)試劑性能和結(jié)果的準(zhǔn)確性，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果與真值的相對(duì)誤差[相對(duì)誤差=(測(cè)定值-真值)/真值×100%]，如表1、圖1所示。結(jié)果表明，Colilert試劑檢測(cè)結(jié)果與真值的相對(duì)誤差最小，檢測(cè)結(jié)果更接近于真值。計(jì)算3種試劑檢測(cè)結(jié)果相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)差，可得總大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)差：SD(Colilert)=5.54，SD(QT)=19.87，SD(LI)=34.30，大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)差：SD(Colilert)=7.26，SD(QT)=14.27，SD(LI)=25.84?？芍珻olilert試劑標(biāo)準(zhǔn)差最小，表明其檢測(cè)結(jié)果與真值的相對(duì)誤差離散程度較小，性能較為穩(wěn)定；LI試劑的標(biāo)準(zhǔn)差最大，表明其性能不穩(wěn)定，結(jié)果波動(dòng)性較大。

表1 3種試劑檢測(cè)NSI定量質(zhì)控樣品的結(jié)果Tab.1 Results of NSI Quantitative Quality Control Samples (QC) Detected by Three Reagents

圖1 3種試劑檢測(cè)結(jié)果真值的相對(duì)誤差Fig.1 Relative Error between Test Samples and Trueth-Values

2.2 單一菌種質(zhì)控及陰性菌：大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌檢測(cè)

Colilert、 LI、 QT檢測(cè)單一菌種質(zhì)控及陰性菌。3種試劑的檢測(cè)結(jié)果均在質(zhì)控樣品結(jié)果可接受范圍內(nèi)。QT試劑大腸埃希氏菌結(jié)果與總大腸菌群結(jié)果不一致，證明了2.1節(jié)的推斷，即該試劑對(duì)大腸埃希氏菌的顯色反應(yīng)不穩(wěn)定，不能用于大腸埃希氏菌的檢測(cè)，如表2所示。3種試劑對(duì)陰性菌銅綠假單胞菌均能有效辨別。計(jì)算檢測(cè)結(jié)果與真值的相對(duì)誤差，結(jié)果表明， Colilert試劑檢測(cè)結(jié)果與真值的相對(duì)誤差最小，檢測(cè)結(jié)果更接近于真值。

表2 3種試劑檢測(cè)單一菌種質(zhì)控及陰性菌結(jié)果Tab.2 Results of Single Strain QC and Non-Target Bacteria Detected by Three Reagents

2.3 實(shí)際水樣

(1)3種試劑檢測(cè)二次供水、管網(wǎng)水總大腸菌群，并對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，結(jié)果如表3所示。Colilert、LI和QT陽(yáng)性檢出率，二次供水分別為11.43%、5.71%和45.71%，管網(wǎng)水分別為0.00、3.33%、26.67%。提取二次供水和管網(wǎng)水陽(yáng)性孔菌體的DNA，測(cè)定16S rDNA，進(jìn)行菌種鑒定，確認(rèn)陽(yáng)性結(jié)果的真實(shí)性。測(cè)序結(jié)果表明，Colilert陽(yáng)性結(jié)果的樣品均含有總大腸菌群，即檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果吻合。LI陽(yáng)性結(jié)果3組，E-31為真陽(yáng)性，E-6和G-8兩組結(jié)果為假陽(yáng)性，假陽(yáng)性率為66.6%，陽(yáng)性樣本漏檢率為75%。QT檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果24組，1組為真陽(yáng)性，其余23組均為假陽(yáng)性，假陽(yáng)性率為95.8%，陽(yáng)性漏檢率為75%。

(2)對(duì)原水總大腸菌群，Colilert、LI和QT的實(shí)際檢測(cè)結(jié)果如表4所示。

運(yùn)用軟件SPSS Statistics 19，對(duì)Colilert、LI和QT檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，為了使數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)處理后再進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。

由表3可知：Colilert 與LI、QT的泊松相關(guān)系數(shù)為0.495和0.319，屬弱相關(guān)；P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異。結(jié)果表明，LI、QT在檢測(cè)原水總大腸菌群時(shí)，與Colilert的檢測(cè)結(jié)果具有差異性。

表3 3種試劑對(duì)二次供水、管網(wǎng)水的檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果Tab.3 Testing and Sequencing Results of Three Reagents for Secondary Water Supply and Pipeline Water

序號(hào)水樣類(lèi)型Colilert[MPN·(100 mL)-1]16S rDNALI[MPN·(100 mL)-1]16S rDNAQT[MPN·(100 mL)-1]16S rDNAG-5管網(wǎng)水0-0-0-G-6管網(wǎng)水0-0-5假陽(yáng)性G-7管網(wǎng)水0-0-0-G-8管網(wǎng)水0-1假陽(yáng)性0-G-9管網(wǎng)水0-0-0-G-10管網(wǎng)水0-0-0-G-11管網(wǎng)水0-0-0-G-12管網(wǎng)水0-0-0-G-13管網(wǎng)水0-0-0-G-14管網(wǎng)水0-0-0-G-15管網(wǎng)水0-0-0-G-16管網(wǎng)水0-0-1假陽(yáng)性G-17管網(wǎng)水0-0-1假陽(yáng)性G-18管網(wǎng)水0-0-0-G-19管網(wǎng)水0-0-3假陽(yáng)性G-20管網(wǎng)水0-0-0-G-21管網(wǎng)水0-0-0-G-22管網(wǎng)水0-0-0-G-23管網(wǎng)水0-0-0-G-24管網(wǎng)水0-0-0-G-25管網(wǎng)水0-0-0-G-26管網(wǎng)水0-0-0-G-27管網(wǎng)水0-0-1假陽(yáng)性G-28管網(wǎng)水0-0-0-G-29管網(wǎng)水0-0-0-G-30管網(wǎng)水0-0-0-

3 討論

3.1 混合質(zhì)控檢測(cè)

Colilert、LI、QT對(duì)3組混合質(zhì)控總大腸菌群和大腸埃希氏菌檢測(cè)結(jié)果真值相對(duì)誤差絕對(duì)值的平均值分別為14.35%、36.55%、21.70%和15.51%、32.34%、72.26%。Colilert 檢測(cè)定量質(zhì)控結(jié)果真值的相對(duì)誤差小，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確；LI和QT檢測(cè)結(jié)果真值的相對(duì)偏差較大。標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果計(jì)算表明，Colilert試劑標(biāo)準(zhǔn)差最小，表明其檢測(cè)結(jié)果與真值的相對(duì)誤差離散程度較小，性能較為穩(wěn)定；LI試劑的標(biāo)準(zhǔn)差最大，表明其性能不穩(wěn)定，結(jié)果波動(dòng)性較大。同時(shí)，總大腸菌群和大腸埃希氏菌的檢測(cè)結(jié)果表明，QT不能辨別大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌，檢測(cè)大腸埃希氏菌時(shí)存在誤判的可能。

3.2 單一質(zhì)控及陰性菌檢測(cè)

Colilert、LI、QT對(duì)3組單一菌種質(zhì)控總大腸菌群和大腸埃希氏菌檢測(cè)結(jié)果真值相對(duì)誤差絕對(duì)值的平均值分別為6.92%、25.6%、20.7%和6.87%、35.02%、6.67%。但是，QT檢測(cè)大腸埃希氏菌單一質(zhì)控時(shí)，總大腸菌群和大腸埃希氏菌檢測(cè)結(jié)果數(shù)值不一樣，熒光顏色較弱或呈藍(lán)綠色熒光，檢測(cè)數(shù)值偏低，有假陰性風(fēng)險(xiǎn)。因此，判斷QT不能有效辨別大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌，檢測(cè)大腸埃希氏菌時(shí)存在誤判的可能。另外，LI培養(yǎng)基溶解后，顯示淡黃色，增加了結(jié)果判讀的難度。

表4 3種試劑檢測(cè)原水的結(jié)果Tab.4 Testing Results of Raw Water by Three Reagents

表5 3種試劑對(duì)原水檢測(cè)結(jié)果的t檢驗(yàn)Tab.5 Results of t-Test of Raw Water by Three Reagents

3.3 實(shí)際水樣檢測(cè)

對(duì)于二次供水和管網(wǎng)水，Colilert 陽(yáng)性結(jié)果與16S rDNA測(cè)序結(jié)果吻合；LI假陽(yáng)性率為66.6%，陽(yáng)性樣本漏檢率為75%；QT檢測(cè)假陽(yáng)性率為95.8%，陽(yáng)性漏檢率為75%。因此，在檢測(cè)實(shí)際水樣的過(guò)程中，2種酶底物試劑有漏檢陽(yáng)性水樣的風(fēng)險(xiǎn)，增加了水質(zhì)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的不可信度；假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的出現(xiàn)，會(huì)增加水質(zhì)實(shí)驗(yàn)室排查水質(zhì)隱患的工作量。對(duì)于原水的檢測(cè)，2種酶底物試劑與Colilert 具有弱相關(guān)性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異，和管網(wǎng)與二次供水的結(jié)果可互相驗(yàn)證。

4 結(jié)論

Colilert 試劑質(zhì)控樣品檢測(cè)結(jié)果與真值相對(duì)誤差較小，實(shí)際水樣檢測(cè)未出現(xiàn)假陽(yáng)性，結(jié)果真實(shí)可靠，性能穩(wěn)定；LI和QT試劑在檢測(cè)質(zhì)控樣品時(shí)，與真值相對(duì)誤差較大，檢測(cè)實(shí)際水樣時(shí)，有假陽(yáng)性和陽(yáng)性漏檢的風(fēng)險(xiǎn)；QT不能有效辨別大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌，檢測(cè)大腸埃希氏菌時(shí)存在誤判的可能。因此，實(shí)驗(yàn)室在選擇酶底物試劑時(shí)，應(yīng)選擇性能優(yōu)良、口碑較好的品牌，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。