精原干細(xì)胞體外三維培養(yǎng)法的研究進(jìn)展

姚瑩，武露明，何曉，張學(xué)紅

近年臨床上通過放療和化療成功治療了70%以上的兒童癌癥，但是這些治療所致性腺損害后引起的不育癥是長期影響癌癥患者的不良癥狀之一，相關(guān)學(xué)者通過冷凍保存睪丸組織保持男性生育能力和預(yù)防年輕癌癥患者不育癥[1-2]。然而，由于凍融睪丸組織的自體移植存在癌細(xì)胞再次植入風(fēng)險，所以從凍存的睪丸組織中分離精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells，SSCs）并且通過體外培養(yǎng)促進(jìn)SSCs增殖分化產(chǎn)生功能性單倍體精子給不育男性帶來極大的希望。此外，SSCs體外培養(yǎng)對其他不育患者（如非梗阻性無精子癥，睪丸唯支持細(xì)胞綜合征等）恢復(fù)生育力也具有非常重要的意義[3-4]。但是睪丸組織中的SSCs數(shù)量較少[5]。因此，探索支持SSCs增殖并維持其功能和遺傳完整性的良好培養(yǎng)方法是未來研究的重點(diǎn)方向。目前，為了模擬精子發(fā)生，已有不少學(xué)者開發(fā)了各種體外培養(yǎng)系統(tǒng)，盡管尚未達(dá)到體外完全生精的最終目的，但在該領(lǐng)域也取得了很大的進(jìn)步。本文主要綜述SSCs體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)，以便為進(jìn)一步改良培養(yǎng)方法提供思路。

1 SSCs

SSCs是位于睪丸曲細(xì)精管基底膜上的一小群生殖細(xì)胞，持續(xù)進(jìn)行著高度協(xié)調(diào)有序的精子發(fā)生。SSCs作為生殖干細(xì)胞，與胚胎干細(xì)胞一樣具有增殖、分化潛能。對于成年男性來講，SSCs是唯一可以不斷地產(chǎn)生精子并將遺傳信息傳遞給下一代的生殖細(xì)胞。SSCs的自我更新和分化受內(nèi)因和外因的精確調(diào)控。SSCs存在的微環(huán)境稱作干細(xì)胞生態(tài)位，也稱壁龕。SSCs壁龕中的體細(xì)胞（如支持細(xì)胞）為SSCs增殖分化提供重要的生長因子：堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）[6-7]。間質(zhì)細(xì)胞和管周細(xì)胞為SSCs提供定位所必需的指導(dǎo)信號[8]，主要由膠原蛋白Ⅳ、層黏連蛋白、巢蛋白和基底膜聚糖組成的基底膜為SSCs提供錨固基礎(chǔ)[9]。然而，目前對SSCs的認(rèn)識還遠(yuǎn)不夠，在輔助生殖技術(shù)和干細(xì)胞治療方面還沒有充分發(fā)揮其潛力，這在很大程度上是由于缺乏對SSCs壁龕組成以及SSCs自我更新所涉及的復(fù)雜調(diào)控途徑的全面了解。

2 SSCs體外培養(yǎng)

為了提高體外培養(yǎng)中SSCs的增殖分化效率、進(jìn)行相關(guān)基因和藥理學(xué)研究，從20世紀(jì)80年代至今，SSCs體外培養(yǎng)法得到了逐步的改進(jìn)和完善。傳統(tǒng)的二維體外培養(yǎng)法是在培養(yǎng)皿上涂一層薄薄的明膠、膠原蛋白或基質(zhì)[10]，在此基礎(chǔ)上根據(jù)有無飼養(yǎng)細(xì)胞的添加可分為飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法和無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法。Maghen等[11]用人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層與SSCs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)SSCs增殖能力顯著提高。雖然飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法可以為SSCs體外生長提供機(jī)械支持和各種生長因子，但此培養(yǎng)條件復(fù)雜且不可控。Suyatno等[12]在無血清和飼養(yǎng)層條件下用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿，并在培養(yǎng)皿中添加GDNF和牛白血病抑制因子（bLIF），發(fā)現(xiàn)牛的SSCs體外培養(yǎng)可長達(dá)2個月。雖然二維體外培養(yǎng)法也取得了一定研究成果，但是由于二維培養(yǎng)法缺乏相對立體的空間結(jié)構(gòu)而不能有效地模擬體內(nèi)SSCs壁龕，導(dǎo)致SSCs分化效率相對較低。為了探索一種能有效替代基底膜和體細(xì)胞的體外環(huán)境劑，以構(gòu)建支持精子發(fā)生發(fā)展的小管結(jié)構(gòu)，三維培養(yǎng)系統(tǒng)越來越受關(guān)注。SSCs的三維培養(yǎng)，是把從曲細(xì)精管中分離出的生殖細(xì)胞植入到相對較厚（幾毫米至幾厘米）的半固體培養(yǎng)基中，為SSCs和其他體細(xì)胞的接觸提供支持媒介，維持或部分維持干細(xì)胞龕（niche）的功能，從而完成精子發(fā)生過程[10]。Sun等[13]通過減數(shù)分裂染色質(zhì)擴(kuò)散和DNA含量測定表明人類SSCs在三維培養(yǎng)下可以分化為功能性單倍體精子，并且此單倍體精子能夠使小鼠卵母細(xì)胞受精，使雜交胚胎的發(fā)育成為可能。此外該研究還發(fā)現(xiàn)，與二維培養(yǎng)法相比，三維培養(yǎng)法在SSCs分化為精母細(xì)胞和精細(xì)胞過程中誘導(dǎo)基因表達(dá)的作用更好。

3 三維培養(yǎng)法

現(xiàn)有4種三維培養(yǎng)法的組成和特點(diǎn)，見表1。下面詳述各方法的研究現(xiàn)狀。

3.1 軟瓊脂三維培養(yǎng)法 瓊脂是一種從紅海雜草中提取的生物相容性復(fù)雜多糖，Lin等[14]首次使用瓊脂建立三維軟瓊脂培養(yǎng)系統(tǒng)（soft-agar culture system，SACS），發(fā)現(xiàn)了骨髓干細(xì)胞的克隆擴(kuò)增特征。此后，多個研究小組利用三維SACS研究雄性生殖細(xì)胞的體外增殖分化。2008年有學(xué)者在SSCs體外培養(yǎng)中引入三維SACS，該系統(tǒng)是由基于不同瓊脂濃度的兩個部分組成，包括富集SSCs的凝膠相和富含體細(xì)胞（如支持細(xì)胞）的固體相[10]。將從10日齡小鼠獲得的SSCs與凝膠相（0.35%瓊脂）混合在固體相（0.5%瓊脂）中孵育時，觀察到減數(shù)分裂階段的特異性標(biāo)志物表達(dá)，表明將體細(xì)胞與生殖細(xì)胞共培養(yǎng)能有效地促進(jìn)生殖細(xì)胞增殖、分化。2012年Abu Elhija等[15]在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)三維SACS可作為減數(shù)分裂前生殖細(xì)胞向減數(shù)分裂后生殖細(xì)胞分化并且最終產(chǎn)生功能性單倍體精子的體外培養(yǎng)法。由于所有技術(shù)在用于臨床前必須在其他物種包括在人類中進(jìn)行重復(fù)成功驗(yàn)證。2016年Reda等[16]在大鼠實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)SSCs在三維SACS體外培養(yǎng)中可成功分化為具有圓形精子形態(tài)特征和蛋白標(biāo)記的單倍體精子。有研究發(fā)現(xiàn)與小鼠相比，大鼠睪丸放療后生精功能恢復(fù)延遲，但恢復(fù)期比人類短，所以大鼠模型的應(yīng)用被認(rèn)為是從小鼠模型向臨床應(yīng)用邁進(jìn)的過程[17]。2019年Mohammadzadeh等[3]從非阻塞性無精子癥患者中分離的SSCs先置于指定培養(yǎng)基上增殖3周，然后將增殖的SSCs分別置于三維SACS組、明膠組和對照組中培養(yǎng)2周，三維SACS組的細(xì)胞團(tuán)數(shù)量明顯高于其他兩組，培養(yǎng)前僅在睪丸細(xì)胞中觀察到Oct4（SSCs干細(xì)胞性標(biāo)記基因）表達(dá)，培養(yǎng)7 d后，在三維SACS組和明膠組中觀察到Stra8（減數(shù)分裂前標(biāo)記基因）的最大表達(dá)，但在培養(yǎng)14 d后，其表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與其他組相比，三維SACS組14 d后Scp3（減數(shù)分裂中標(biāo)記基因）和Acrosin（減數(shù)分裂后標(biāo)記基因）的表達(dá)更高，說明三維SACS對人SSCs的增殖和分化具有積極作用，同時由于三維SACS組克隆的細(xì)胞團(tuán)數(shù)明顯高于明膠組，進(jìn)一步表明三維培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)于二維培養(yǎng)系統(tǒng)。然而，SACS在體外生精中的應(yīng)用并非沒有缺陷，有研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的最初24 h內(nèi)，有相當(dāng)一部分鼠類SSCs（40%～70%）從SACS的上層凝膠階段丟失，這可能是由于細(xì)胞相互作用的喪失和隨后觸發(fā)的凋亡級聯(lián)反應(yīng)，甚至有證據(jù)表明人類生精細(xì)胞無法有效地在三維SACS中完成整個生精周期[18-19]。

表1 4種三維培養(yǎng)法的組成及特點(diǎn)

3.2 甲基纖維素三維培養(yǎng)法 甲基纖維素是一種非離子纖維素醚，其是通過醚化在纖維素中引入甲基而制成的。甲基纖維素有4種重要功能：增稠、表面活性、成膜性以及形成熱凝膠（冷卻時熔化）。2009年Stukenborg等[18]提出甲基纖維素培養(yǎng)系統(tǒng)（methylcellulose culture system，MCS）可作為生殖細(xì)胞體外培養(yǎng)的另一種三維培養(yǎng)法，該系統(tǒng)允許小鼠減數(shù)分裂前的雄性生殖細(xì)胞在體外通過減數(shù)分裂成熟為形態(tài)正常的精子。2015年Huleihel等[20]用取自恒河猴（一種高度進(jìn)化的靈長類動物）的SSCs在三維甲基纖維素系統(tǒng)（由42%的甲基纖維素組成）中培養(yǎng)，表明MCS三維培養(yǎng)系統(tǒng)可以提供有助于SSCs增殖分化至關(guān)重要的元素。2018年Abofoul-Azab等[21]首次在經(jīng)歷放射治療的青春期前癌癥患者的睪丸中分離出具有生物活性的SSCs，發(fā)現(xiàn)SSCs在體外MCS三維培養(yǎng)中可以增殖，并且向不同的精子形成階段分化（如減數(shù)分裂中或者減數(shù)分裂后），最終成功分化出單倍體精子樣細(xì)胞，此發(fā)現(xiàn)可能為青春期前癌癥男孩的生育保護(hù)和無精子癥患者的新治療策略提供思路。2019年又有研究首次從無精子的睪丸唯支持細(xì)胞綜合征患者活檢睪丸組織中分離出SSCs，并在體外MCS三維培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)SSCs發(fā)生減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后變化[4]。此研究一方面表明，睪丸唯支持細(xì)胞綜合征患者無法在體內(nèi)完成精子形成可能與睪丸微環(huán)境和支持細(xì)胞功能受損有關(guān)，另一方面也證明甲基纖維素三維培養(yǎng)系統(tǒng)可以提供一種近似體內(nèi)微環(huán)境的培養(yǎng)條件。相比膠原作為培養(yǎng)基質(zhì)，MCS的使用使我們有更多機(jī)會從三維基質(zhì)中提取培養(yǎng)細(xì)胞，隨后使用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行更詳細(xì)的分析，流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞的評價可以進(jìn)一步驗(yàn)證分子、形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)等方法對細(xì)胞的分析結(jié)果[18]。

3.3 納米纖維支架三維培養(yǎng)法 納米纖維基質(zhì)可以模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的結(jié)構(gòu)和功能，其支架為SSCs提供更好的三維空間、生物模擬和信號傳遞，納米纖維支架三維培養(yǎng)系統(tǒng)可用于再生醫(yī)學(xué)、組織工程、輔助生殖技術(shù)以及治療青春期前癌癥患者的不育癥[9]。納米纖維支架的特性（例如纖維排列，纖維直徑和孔徑，以及機(jī)械性能）都可以被調(diào)節(jié)以高度模擬體內(nèi)特定部位微環(huán)境。相比無支架體外培養(yǎng)，納米纖維支架的多孔結(jié)構(gòu)（＞80%～95%）有助于營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和廢物的大規(guī)模運(yùn)輸和交換，進(jìn)而更有利于SSCs的體外培養(yǎng)。此外，在較長時間的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)基的交換相對容易，而且納米纖維支架也可以被不同的活性化合物（如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白）包覆，以滿足目標(biāo)實(shí)驗(yàn)需要[22-23]。2013年Eslahi等[24]研究了未成熟小鼠凍融的SSCs和凍融睪丸組織碎片在聚L乳酸（PLLA）納米纖維支架中的培養(yǎng)情況，3周后精原性標(biāo)記基因（Itgα6、Itgβ1、PLZF和Oct4）的表達(dá)得以維持，PLLA納米纖維支架上新鮮和凍融的SSCs的增殖明顯增加；此外，在納米纖維上培養(yǎng)的凍融細(xì)胞中某些精原特異基因的表達(dá)明顯減少以及精原細(xì)胞分化標(biāo)記基因（c-Kit）的表達(dá)增加，說明納米纖維支架也可以用于SSCs的分化。體外培養(yǎng)中使用的另一種納米纖維支架是聚酰胺納米絲狀物，其是由不規(guī)則的靜電紡絲制成，其結(jié)構(gòu)與基膜相似，為細(xì)胞聚集創(chuàng)造了更好的條件[25]。Shakeri等[26]報(bào)道了在體外培養(yǎng)過程中，由靜電紡聚酰胺納米絲狀物組成的三維納米纖維基質(zhì)對從6日大的小鼠睪丸中獲取的SSCs增殖分化以及功能的影響。在納米纖維表面培養(yǎng)7 d后，SSCs細(xì)胞團(tuán)數(shù)量、每個細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞團(tuán)的平均面積均有所增加（P＜0.05）。此研究發(fā)現(xiàn)納米纖維為支持細(xì)胞維持其旁分泌提供更好的微環(huán)境，并且可以影響SSC的增殖和分化。2020年Ziloochi等[27]在研究瓊脂/聚乙烯醇納米纖維（PVA）支架對新生兒睪丸SCCs增殖效率和分化潛能的影響中發(fā)現(xiàn)，瓊脂/PVA支架與生長因子補(bǔ)充的培養(yǎng)基相結(jié)合協(xié)同增加了小鼠SSCs向精母細(xì)胞和減數(shù)分裂后細(xì)胞的分化率。因此，瓊脂/PVA納米纖維支架在修復(fù)不育特別是無精子男性不育方面具有潛在的應(yīng)用價值。

3.4 脫細(xì)胞生物支架三維培養(yǎng)法 脫細(xì)胞是用于組織工程的一種常用方法[28]，為了保護(hù)組織的調(diào)節(jié)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，模擬器官功能，可以使用酶、化學(xué)、物理或這些方法的結(jié)合去除目標(biāo)組織的細(xì)胞和DNA。組織工程的主要成分是支架（又稱細(xì)胞外基質(zhì)），細(xì)胞、生長因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等可以在支架中組合使用[28]。值得注意的是，脫細(xì)胞支架比人工合成支架（如軟瓊脂、甲基纖維素、納米纖維素等三維培養(yǎng)法）具有更好的結(jié)構(gòu)和生化性能，這些特點(diǎn)可以更好地支持細(xì)胞遷移、增殖、分化、組織形成以及蛋白表達(dá)[29]。2018年Vermeulen等[30]將豬的未成熟睪丸組織（ITT）用不同的方案進(jìn)行脫細(xì)胞處理以產(chǎn)生細(xì)胞相容性支架，蘇木精伊紅染色顯示，在所有脫細(xì)胞組織中，睪丸結(jié)構(gòu)保存完好，空的生精小管清晰可辨，免疫組化發(fā)現(xiàn)所有脫細(xì)胞方案后ECM相關(guān)蛋白同樣保存完好，與不使用支架培養(yǎng)的干細(xì)胞相比，使用支架培養(yǎng)的干細(xì)胞增殖率更高，干細(xì)胞因子分泌量也更大。但是該研究沒有此培養(yǎng)條件下SSCs的分化情況。2019年Vermeulen等[31]再次對豬低溫保存ITT進(jìn)行脫細(xì)胞處理開發(fā)水凝膠來創(chuàng)建睪丸類器官，發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞ITT開發(fā)的睪丸類器官中生長因子保存較好，因此具有較好的恢復(fù)生殖能力的潛力。2020年Majidi Gharenaz等[32]用脫細(xì)胞小鼠全睪丸作為培養(yǎng)SSCs的天然三維支架，此支架經(jīng)注射SSCs后被重新細(xì)胞化，培養(yǎng)8周對細(xì)胞化支架進(jìn)行組織學(xué)評估發(fā)現(xiàn)，注射的SSCs固定在生精小管基底膜上，實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分析顯示SSCs發(fā)生減數(shù)分裂，表明SSCs注入脫細(xì)胞睪丸支架后可增殖分化為精母細(xì)胞，但是培養(yǎng)8周后并未發(fā)現(xiàn)圓形精子，提示SSCs并沒有完成產(chǎn)生功能性精子的全過程。

4 三維培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)和不足

4.1 三維培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn) ①高度模擬體內(nèi)SSCs壁龕微環(huán)境，加深對生殖細(xì)胞與體細(xì)胞之間以及生殖細(xì)胞與ECM之間相互作用的認(rèn)識，摸索SSCs體外增殖、分化所需要的最佳時間和空間條件。②體外精子發(fā)生三維培養(yǎng)體系的建立也將使一些在體內(nèi)難以直接進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)成為可能，如新藥或潛在毒物對人類精子發(fā)生的藥學(xué)或毒理學(xué)研究。③人類單倍體男性生殖細(xì)胞的體外成功產(chǎn)生，將為那些因癌癥治療面臨不育的青春期前癌癥患者，或者其他原因造成的成年男性不育患者保留生育能力帶來希望。

4.2 三維培養(yǎng)法的不足 ①用于確定SSC干細(xì)胞特性的標(biāo)記物不統(tǒng)一。②SSCs分化產(chǎn)生的精子數(shù)量較少。③不能直接檢測精子活力，無法確定受精能力。④軟瓊脂培養(yǎng)系統(tǒng)難以從凝膠中回收細(xì)胞，脫細(xì)胞生物支架培養(yǎng)系統(tǒng)仍需優(yōu)化脫細(xì)胞方案避免對ECM造成損傷。

5 結(jié)語

精原干細(xì)胞三維體外培養(yǎng)法的不斷改進(jìn)對研究精子發(fā)生相關(guān)分子機(jī)制、臨床治療及再生醫(yī)學(xué)具有重要價值。相比軟瓊脂培養(yǎng)法存在細(xì)胞間相互作用丟失的可能，甲基纖維素培養(yǎng)法可以相對簡單的獲取培養(yǎng)細(xì)胞，納米纖維素培養(yǎng)法便于更換培養(yǎng)基、相對延長培養(yǎng)時間，脫細(xì)胞天然三維培養(yǎng)方法更貼合體內(nèi)微環(huán)境。然而SSCs三維體外培養(yǎng)法仍較多地應(yīng)用于動物實(shí)驗(yàn)，許多問題亟待解決，例如：SSCs樣本獲取有限、體外分化效率低、不能有效檢測生殖細(xì)胞活性等問題，以及尚未明確人類生殖細(xì)胞發(fā)育的適用性和精子產(chǎn)生后代的功能。因此，積極解決上述問題將成為男性生殖及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新的研究重點(diǎn)。