火艷麗，薛林貴，常思靜，馬梅蘭，陳娟博

(蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，蘭州 730070)

鐵礦石的開采、加工和冶煉過程都會帶來大量的尾礦堆積，產(chǎn)生一系列的環(huán)境問題[1].鐵尾礦中的Fe、Mn、Zn、Cu、Pb、Cd等重金屬元素，易污染土壤，危害人體健康和植物生長[2].鐵過量，對于人體來說，過量的鐵會儲存于肝臟，使肝臟受到損傷，繼而引發(fā)肝細(xì)胞瘤和肝纖維化等疾病，有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)鐵的過量與肝臟、肺、食道、腸道等多器官的腫瘤相關(guān)[3]，對于植物體，過多的鐵會引起鐵中毒，使植物的生長受到抑制[4].

生物修復(fù)是重金屬污染土壤的修復(fù)方法之一，通過植物、動物、微生物及其他生物的生命活動，實(shí)現(xiàn)土壤中有害物質(zhì)的降解、轉(zhuǎn)化、吸收[5].這種方法是公認(rèn)的生態(tài)友好型修復(fù)方法，成本相對較低，不易造成二次污染.

微生物對重金屬的耐受機(jī)理較為復(fù)雜，從國內(nèi)外研究學(xué)者的報(bào)告中可以看出，主要是通過其菌體表面的氧化還原作用、吸附與絡(luò)合效應(yīng)、胞外沉淀作用、靜電結(jié)合作用、離子交換型吸附作用、胞內(nèi)累積效應(yīng)等方式實(shí)現(xiàn)[6-7].微生物在重金屬離子脅迫的條件下，耐受力較弱的微生物可能會快速減少或者死亡，耐受力較強(qiáng)的微生物能夠正常存活[8]，因而有許多研究學(xué)者篩選和馴化可以耐受重金屬離子的微生物，已獲得了Cd耐性菌株[9-10]、Pb耐性菌株[11-12]、Zn耐性菌株[12-13]、Mn耐性菌株[14]以及Cu耐性菌株[9,15]，魏波等[16]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1450果酒酵母能夠耐受1.52 mol/L的FeSO4；張曉東[17]篩選到1株耐鐵(FeSO4)500 mg/L蠟狀芽孢桿菌(Bacillustoyonensis)；魏超等[18]通過高Fe選擇性培養(yǎng)基，分離出1株耐鐵的希瓦氏菌(Shewanellasp.)，該菌可在50 mg/mL FeSO4液體培養(yǎng)基中生長.這些菌株能夠耐受較高濃度的重金屬離子，為微生物法修復(fù)重金屬污染環(huán)境提供了研究材料.但土壤調(diào)查顯示，重金屬污染的土壤中通常存在著多種重金屬離子，而非某一種重金屬離子造成的單一污染[19].因此，僅用一種重金屬元素篩選出來的某一種重金屬離子的耐受菌株，可能會出現(xiàn)不能耐受其他重金屬離子的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致生物修復(fù)實(shí)踐中的修復(fù)效果受限.目前針對單一菌株對多種重金屬離子共同修復(fù)的報(bào)道相對較少.

本文采集張掖市臨澤縣平川鎮(zhèn)鐵尾礦礦區(qū)的土壤，擬篩選出能夠耐受高濃度Fe3+的細(xì)菌，優(yōu)化其培養(yǎng)條件，并研究該菌株對多種重金屬離子的耐受性，以期合理開發(fā)自然界中鐵尾礦修復(fù)的微生物資源，為尾礦污染環(huán)境的生態(tài)修復(fù)提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 供試樣品

供試土壤樣品采自張掖市臨澤縣平川鎮(zhèn)鐵尾礦礦區(qū)(N 39°30′，E 100°15′)表層5～10 cm 的土壤，樣品采集后放于無菌密封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，過篩，分裝，取部分土壤進(jìn)行試驗(yàn)，其余土壤樣品分別置于4 ℃和-80 ℃冰箱貯存.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

所用生化試劑均購于甘肅金博研生物科技有限公司，重金屬離子母液配制方法為：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的固體重金屬離子鹽溶解后定容，過濾除菌后貯存待用.

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母浸出粉0.5%；氯化鈉1%；蛋白胨1%；pH值7.0～7.2；固體培養(yǎng)基加瓊脂1.5%～2%.

LB’培養(yǎng)基：酵母浸出粉0.5%；氯化鈉0.5%；蛋白胨1%；pH值7.0～7.2；固體培養(yǎng)基加瓊脂1.5%～2%.

選擇培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基添加相應(yīng)濃度的金屬離子溶液.

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選

取過篩的鐵尾礦土樣5 g，加入45 mL濃度為0.9%的無菌生理鹽水中，置于搖床振蕩1 h，靜置后取5 mL上清液，轉(zhuǎn)接到Fe3+(化合物FeCl3·6H2O)濃度50 mg/L的45 mL培養(yǎng)基中，在溫度為30 ℃下振蕩培養(yǎng)48 h；取0.1 mL菌液梯度稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌懸液，取10-4、10-5、10-6濃度的菌懸液0.2 mL分別涂布Fe3+濃度50 mg/L的固體培養(yǎng)基，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)菌的生長狀況；若生長狀況良好，則取5 mL Fe3+濃度50 mg/L的菌液轉(zhuǎn)接到含F(xiàn)e3+濃度100 mg/L的45 mL新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h.

按照上述步驟，參考凌薇薇[14]的方法，將培養(yǎng)后的菌液依次轉(zhuǎn)接到Fe3+濃度200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L的45 mL新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h.取0.1 mL菌液(Fe3+濃度1 000 mg/L)，用無菌水梯度稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌懸液，取10-4、10-5、10-6濃度的菌懸液0.2 mL分別涂布Fe3+濃度1 000 mg/L的平板，重復(fù)涂布3個平板作為平行實(shí)驗(yàn)，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h.挑選培養(yǎng)基上長勢情況較好、菌落形態(tài)有差異的單菌落，用平板劃線法進(jìn)行分離純化，反復(fù)劃線培養(yǎng)，直到獲得單克隆菌落，將獲得的菌株編號，并用甘油凍存法置于-80 ℃冰箱凍存.

1.2.2 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線，直到長出單菌落后，記錄菌落的顏色、形狀、大小、透明度、是否隆起、邊緣特征及光滑度等生物學(xué)性狀.通過單染色觀察菌株在顯微鏡下的形態(tài)及細(xì)胞大小；通過革蘭氏染色反應(yīng)觀察染色反應(yīng)的特性.

分子生物學(xué)鑒定：用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，polymerase chain reaction)的方法，以菌株總DNA為模板，16s rRNA分子序列為目標(biāo)序列，對菌種進(jìn)行鑒定.

在PCR反應(yīng)體系中加入DNA模板1.0 L，上游引物27F 1.0 L，下游引物1492R 1.0 L，Premix Taq 12.5 L，加雙蒸水至總量25.0 L，混勻后置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng).反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃總延伸10 min.

PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，PCR產(chǎn)物送擎科公司進(jìn)行測序；得到的16s rRNA序列，通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的Nucleotide Blast程序進(jìn)行序列相似性比對，確定菌株的物種分類，并用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株與相似物種的親緣關(guān)系.

1.2.3 培養(yǎng)條件對菌株生長的影響

以pH 7.0、2%接種量、150 r/min、1% NaCl、30 ℃為基準(zhǔn)條件，研究不同接種量、不同溫度、不同pH值、不同滲透壓和不同通氣量對菌株生長的影響.

接種量：按照接種量1%、2%、3%、4%、5%(每個接種量3個重復(fù))，其他條件均為基準(zhǔn)條件，搖床培養(yǎng)24 h取樣，用紫外分光光度儀測定菌體OD600的數(shù)值.

溫度：按照溫度梯度20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃(每個溫度3個重復(fù))，其他條件均為基準(zhǔn)條件，分別置于相應(yīng)溫度的搖床培養(yǎng)24 h取樣，測菌體OD600.

pH值：按照pH值5，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8(每個pH值3個重復(fù))，其他條件均為基準(zhǔn)條件，搖床培養(yǎng)24 h取樣，用紫外分光光度儀測定菌體OD600的數(shù)值.

NaCl濃度的影響：菌株以2%的接種量，分別接種于pH值為7.0、NaCl終濃度分別為0%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%的液體LB培養(yǎng)基中(每個NaCl濃度3個重復(fù))，其他條件均為基準(zhǔn)條件，搖床培養(yǎng)24 h取樣，用紫外分光光度儀測定菌體OD600的數(shù)值.

搖床轉(zhuǎn)速：搖床轉(zhuǎn)速依次設(shè)為100、120、150、180、200 r/min(每個轉(zhuǎn)速3個重復(fù))，其他條件均為基準(zhǔn)條件，分別置于相應(yīng)轉(zhuǎn)速的搖床中培養(yǎng)24 h取樣，用紫外分光光度儀測定菌體OD600的數(shù)值.

1.2.4 菌株對Fe3+耐受能力的測定

菌株在固體LB’培養(yǎng)基上劃線活化，培養(yǎng)待長出單菌落后，挑取適量單菌落接種到液體LB’培養(yǎng)基中，置入搖床振蕩培養(yǎng)14 h做為種子液，按照1%的接種量將種子液分別接種于Fe3+終濃度為50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L的液體LB’培養(yǎng)基中(每個濃度3個重復(fù))，置于30 ℃的搖床中以150 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長狀況并取樣，以空白液體培養(yǎng)基為對照，用紫外分光光度儀測定菌液在600 nm處的吸光值，以O(shè)D600的數(shù)值表征培養(yǎng)液中的菌體濃度，評估菌株在富含F(xiàn)e3+培養(yǎng)基中的生長狀況.

1.2.5 菌株對不同重金屬離子耐受能力的測定

菌種的活化和種子液的制備同1.2.4.菌株以1%的接種量，分別接種于添加有各個終濃度(如表1所列)金屬離子的液體LB’培養(yǎng)基中(每個濃度3個重復(fù))，各組均置于30 ℃的搖床中以150 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長狀況并取樣，以空白液體培養(yǎng)基為對照，用紫外分光光度儀測定菌液在600 nm處的吸光值，以O(shè)D600的數(shù)值表征培養(yǎng)液中的菌體濃度，評估菌株在不同濃度的重金屬離子存在時的生長狀況.

表1 各個金屬離子及其添加終濃度梯度Tab.1 Each metal ion and its final concentration gradient mg/L

1.2.6 菌株對5種重金屬離子共同耐受能力的測定

菌種的活化和種子液的制備同1.2.4.將菌株F1以1%的接種量接種于同時含有1 000 mg/L Fe3+、800 mg/L Pb2+、150 mg/L Cd2+、900 mg/L Cu2+和1 100 mg/L Zn2+的液體LB’培養(yǎng)基中，置于30 ℃的搖床中以150 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長狀況并取樣，以空白液體培養(yǎng)基為對照，用紫外分光光度儀測定菌液在600 nm處的吸光值，以O(shè)D600的數(shù)值表征培養(yǎng)液中的菌體濃度，評估菌株在5種重金屬離子同時存在時的生長狀況.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

通過分離純化，從張掖市臨澤縣平川鎮(zhèn)鐵尾礦礦區(qū)篩選到一株耐鐵的細(xì)菌，編號F1.

2.2 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：菌株F1在LB固體培養(yǎng)基中的生長情況如圖1所示，菌株F1在LB固體培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈圓形，乳白色，不透明，表面濕潤有光澤，邊緣較整齊；革蘭氏染色呈陰性.

分子生物學(xué)鑒定：PCR擴(kuò)增后的16S rRNA序列，電泳檢測結(jié)果如圖2所示，目的片段約1 500 bp，條帶明亮.測序后的基因序列經(jīng)過核酸序列同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株F1的16S rRNA序列同Enterobactercloacae4928STDY7071163的相似性達(dá)到100%，與相近種屬菌株進(jìn)行16S rRNA序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)測序結(jié)果，菌株F1鑒定為陰溝腸桿菌Enterobactercloacae.

2.3 培養(yǎng)條件對菌株生長的影響

2.3.1 接種量對菌株F1生長的影響

菌株F1分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量，接種于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，24 h后測定培養(yǎng)液OD600值，結(jié)果如圖4所示：菌株F1在接種量為1%時OD600值最高，菌株生長最好；接種量分別為2%、3%、4%、5%時，OD600值反而降低，所以，菌株F1最適的接種量為1%.總體而言，接種量的多少對菌體生物量的影響不大，但是相比而言，1%接種量的條件下，菌株生長的較好，分析原因，接種量過多，一方面可能因?yàn)榫w競爭利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)；另一方面可能會造成菌體生長過快，比接種量少的菌體更快到達(dá)衰亡期.

2.3.2 溫度對菌株F1生長的影響

為了測定菌株F1的最適生長溫度，菌株F1分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后測定不同的溫度培養(yǎng)條件下的OD600值.結(jié)果見圖5，從圖中可以看出，菌株F1在30 ℃生長的最好，因而，菌株F1的最適生長溫度為30 ℃.當(dāng)溫度低于30 ℃時，菌株生長情況基本良好；當(dāng)溫度為35 ℃時，菌株生長狀況出現(xiàn)下降，低于20 ℃、25 ℃和30 ℃時的生長濃度；當(dāng)培養(yǎng)溫度為40 ℃時，菌株的生長受到顯著抑制，培養(yǎng)液最終濃度僅為30℃培養(yǎng)條件下的48.3%.可以看出，菌株F1的生長溫度范圍廣，在20 ℃～35 ℃的環(huán)境中能很好的生長，但不能耐受高溫.

2.3.3 pH值對菌株F1生長的影響

在最適溫度30 ℃條件下，測定不同的pH值下菌株的OD600值，結(jié)果如圖6所示：在pH值為7的時候，菌株F1生長的最好；pH值在5到8的時候，F(xiàn)1也能良好生長，可見，F(xiàn)1能適應(yīng)較寬范圍的pH值.

2.3.4 NaCl對菌株F1生長的影響

從圖7可以看出，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0%～1.5%之間時，菌液的OD600值均在4以上，其中，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時，菌株F1生長的最好，并且在不添加NaCl的時候也可以較好的生長；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.5%時，逐漸提高NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，菌株的生長狀態(tài)逐漸下降，但是仍然可以生長，說明該菌株能夠耐受一定濃度的NaCl溶液，具有很好的滲透壓調(diào)節(jié)能力，能在高鹽的土壤環(huán)境中存活.

2.3.5 搖床轉(zhuǎn)速對菌株F1生長的影響

將菌株F1接種后置于100～200 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中培養(yǎng)，結(jié)果如圖8所示，當(dāng)在轉(zhuǎn)速150 r/min條件下培養(yǎng)24 h時，菌株F1的生物量最高；轉(zhuǎn)速低于或者高于150 r/min時，生物量均相對降低，因而，F(xiàn)1最適的培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150 r/min.

2.4 菌株F1對Fe3+的耐受能力

由圖9可以看出，當(dāng)Fe3+濃度為1 000 mg/L時，菌株依然生長的很好，但是當(dāng)向液體LB’培養(yǎng)基中添加的Fe3+濃度高于1 000 mg/L時，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)褐色的絮狀沉淀，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿度也不能使沉淀消失，若有沉淀，則可能會使F1實(shí)際利用的有效Fe3+降低.

2.5 菌株F1對不同重金屬離子的耐受能力

菌株F1對Pb2+的耐受能力，如圖10所示，同上述對Fe3+的耐受能力測定時一樣，當(dāng)Pb2+濃度為800 mg/L時，菌株的OD600值為3.94，依然能較好的生長，當(dāng)繼續(xù)增加Pb2+的濃度時，培養(yǎng)基中出現(xiàn)不溶性沉淀，Pb2+溶解趨于飽和.

菌株F1能夠在Cd2+濃度為150 mg/L的培養(yǎng)基中生長，當(dāng)Cd2+濃度為180 mg/L和200 mg/L，菌株均不能生長，如圖10所示.可見，F(xiàn)1能夠耐受150 mg/L的Cd2+.

在含有Cu2+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)Cu2+濃度低于800 mg/L時，菌株生長狀況良好，隨著Cu2+濃度的增加，菌株的生物量逐漸降低；如圖10所示，當(dāng)Cu2+濃度為900 mg/L時，菌株的生物量明顯下降；當(dāng)Cu2+濃度為1 000 mg/L時，菌株不能生長.所以，F(xiàn)1對Cu2+的耐受濃度為900 mg/L.

當(dāng)Zn2+濃度為1 200mg/L時，菌株生長停滯，當(dāng)Zn2+濃度在50 mg/L到1 100mg/L之間時，菌株均能生長.因而，F(xiàn)1能夠耐受1 100 mg/L的Zn2+.

2.6 菌株F1對5種重金屬離子的共同耐受能力

菌株F1在同時含有1 000 mg/L Fe3+、800 mg/L Pb2+、150 mg/L Cd2+、900 mg/L Cu2+和1 100 mg/L Zn2+的液體LB培養(yǎng)基中仍能夠生長，培養(yǎng)24 h后，菌株的OD600平均值為1.23，但生長濃度低于各個重金屬離子單一存在時的生長濃度.

3 結(jié)論

目前關(guān)于鉛、鎘、汞、鉻、銅、鋅、錳等重金屬離子耐受性菌株報(bào)道的較多，而關(guān)于鐵耐受性菌株的報(bào)道較少.本實(shí)驗(yàn)采集張掖市臨澤縣平川鎮(zhèn)鐵尾礦礦區(qū)的土壤樣品，經(jīng)過分離和純化，篩選獲得一株對鐵具有較高耐受性的細(xì)菌F1，通過形態(tài)學(xué)特征和16S rRNA基因序列分析，鑒定其為陰溝腸桿菌Enterobactercloacae.對菌株F1的培養(yǎng)條件和重金屬耐受性進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明：

1) 該菌株最適培養(yǎng)溫度為30 ℃，最適pH值為7.0，說明菌株可以在常溫、中性的自然環(huán)境中很好的生長.

2) 該菌株最適接種量為1%，最適NaCl添加濃度為0.5%，最佳搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min.

3) 重金屬耐受性實(shí)驗(yàn)顯示，該菌株可單獨(dú)在1 000 mg/L Fe3+、800 mg/L Pb2+、150 mg/L Cd2+、900 mg/L Cu2+、1 100 mg/L Zn2+的環(huán)境中生長，也可在上述五種濃度重金屬離子同時存在的環(huán)境中生長，表明該菌株對環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，在多個重金屬離子共同污染土壤的修復(fù)中具有較好的應(yīng)用潛力.