呂芳，孫浩，葉淑紅

大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（大連 116034）

山藥又名山芋，屬于草本類植物，是一種兼用型植物。山藥作為食藥兩用的佳品，其中含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、膽堿、維生素和人體需要的多種微量元素，如鈣、鐵、磷、碘等[1]，還有多種可被人體利用的氨基酸[2]，素有“中國(guó)小人參”的美名[3]。山藥主要用在焙烤和發(fā)酵行業(yè)[4]，其中山藥保健酒（白酒酒精度4%～10%vol）深受消費(fèi)者青睞。

桑黃屬針層孔菌屬[5]，通常作為藥用真菌，用作中藥有兩千多年歷史。桑黃中含有多糖類、甾體類、黃酮類、萜類、呋喃類、吡喃酮類等多種化合物[6]。桑黃具有抗腫瘤作用[7]、抗肝纖維化[8]、降血脂[9]、調(diào)整血糖濃度等功效[10]；并對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等病癥有一定的治療作用[11]。

由于天然桑黃資源稀少，目前桑黃產(chǎn)品主要是針對(duì)高端人群的藥物和保健品，如日本的桑黃多糖顆粒，韓國(guó)的桑黃口服液[12]，產(chǎn)品形式單一，價(jià)格比較昂貴。隨著桑黃養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，市場(chǎng)上期望能有適合廣大消費(fèi)人群的多品類桑黃產(chǎn)品。

基于山藥和桑黃在保健食品方面都具有良好的研究前景，試驗(yàn)以山藥和桑黃為原料，用安琪釀酒酵母作為發(fā)酵劑，研制一款山藥桑黃發(fā)酵酒精飲料。在發(fā)酵過(guò)程中，山藥和桑黃中的有效營(yíng)養(yǎng)素溶出，提高產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善產(chǎn)品感官。試驗(yàn)結(jié)果為桑黃、山藥等藥食原料的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥、桑黃（市售）；安琪釀酒酵母（保藏于大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室）；α-淀粉酶（酶活力50 000 U/g，食品級(jí)，河南擴(kuò)源化工產(chǎn)品有限公司）；纖維素酶（酶活力100 000 U/g，食品級(jí)，和氏璧生物科技有限公司）；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722S可見分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；ZHWY-211B恒溫?fù)u床（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

山藥漿的制備[13]。新鮮山藥切片，經(jīng)護(hù)色（0.5%檸檬酸浸泡20 min）和糊化處理后按比例與水混合，打漿。

山藥酶解[14]。山藥漿中添加山藥干重的2%淀粉酶，在溫度60 ℃條件下水浴60 min。

桑黃酶解。桑黃粉中每克添加500 U纖維素酶，在溫度60 ℃條件下水浴60 min。

調(diào)配：將桑黃酶解液中按比例加入山藥酶解液，充分混合均勻。

滅菌[15]。采用HTU超高溫殺菌30 min，冷卻至40℃進(jìn)行接種。

菌種準(zhǔn)備。將菌種安琪酵母菌活化（肉湯培養(yǎng)基），制成發(fā)酵劑（109CFU/mL）。

發(fā)酵。接種后的料液置于溫度28 ℃恒溫?fù)u床發(fā)酵72 h，取出進(jìn)行調(diào)配。

1.3.3 發(fā)酵工藝單因素條件研究

以還原糖利用率、總糖利用率和感官評(píng)定分?jǐn)?shù)作為考察指標(biāo)，確定單因素的最優(yōu)水平。初始條件為：料液質(zhì)量比1∶8，28 ℃，酵母接種量體積分?jǐn)?shù)2%，裝液量48%，發(fā)酵68 h。控制單因素條件為變量，其他條件為初始值進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.4 發(fā)酵工藝響應(yīng)面試驗(yàn)研究

根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果，設(shè)計(jì)Box-Behnken Design響應(yīng)面模型，選用裝液量（A）、料液質(zhì)量比（B）、發(fā)酵溫度（C）3個(gè)因素，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，優(yōu)化工藝條件，試驗(yàn)因素及編碼表如表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素及編碼表

1.3.5 測(cè)定方法

還原糖，采用3, 5-二硝基水楊酸法[16]；總糖，采用苯酚-硫酸法測(cè)總糖[17]；三萜，采用香草醛-冰醋酸法測(cè)三萜[18]；黃酮，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測(cè)總黃酮[19]；酒精含量，參照王永華《食品分析》酒精含量的測(cè)定[20]；微生物指標(biāo)，GB/T 4789.25—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 酒類檢驗(yàn)》[21]。

1.3.6 感官評(píng)分方法

感官評(píng)定參照GB/T 33404—2016白酒感官品評(píng)導(dǎo)則[22]。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官綜合評(píng)分表

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin、Design Expert V 8.0.6等軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定了復(fù)配原料的比例為：山藥與桑黃質(zhì)量比19∶1。

2.1.1 料液質(zhì)量比對(duì)發(fā)酵過(guò)程總糖和還原糖利用率的影響

在不同的料液質(zhì)量比例下，測(cè)定發(fā)酵液中總糖和還原糖的利用率，結(jié)果如圖1所示。料液質(zhì)量比1∶7時(shí)，還原糖和總糖的總體利用率達(dá)到最大值。這是由于料液質(zhì)量比逐漸減小，原料中的還原糖在水中的浸出率升高[23]，所以還原糖利用率又逐漸升高。但是如若料液質(zhì)量比設(shè)置過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品風(fēng)味較為欠缺。綜合感官評(píng)分考量，最終確定料液質(zhì)量比為1∶7。

圖1 不同料液質(zhì)量比下對(duì)糖的利用率

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程總糖和還原糖利用率的影響

由圖2可知，溫度28 ℃時(shí)，酵母菌對(duì)還原糖和總糖的利用率達(dá)到峰值，隨著溫度升高，酵母菌對(duì)糖的利用率逐漸降低，故最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖2 不同溫度下對(duì)糖的利用率

2.1.3 酵母接種量體積分?jǐn)?shù)對(duì)發(fā)酵過(guò)程總糖和還原糖利用率的影響

由圖3可知，酵母接種量體積分?jǐn)?shù)1.0%時(shí)酵母菌對(duì)還原糖和總糖的利用率最高，酵母接種量體積分?jǐn)?shù)大于1.0%后，利用率趨近于平穩(wěn)，其原因在于菌種繁殖過(guò)多，菌種繁殖過(guò)多導(dǎo)致菌種間的相互競(jìng)爭(zhēng)，所以酵母接種量體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)糖的利用率降低。最終確定酵母接種量體積分?jǐn)?shù)1.0%為最優(yōu)發(fā)酵條件。

圖3 不同酵母接種量體積分?jǐn)?shù)下糖的利用率

2.1.4 裝液量對(duì)發(fā)酵過(guò)程總糖和還原糖利用率的影響

裝液量代表的是發(fā)酵瓶中可溶性氧的含量[24]。由圖4所示，總糖利用率隨著裝液量的改變而改變，總糖利用率在裝液量60%處達(dá)到峰值，而還原糖利用率趨勢(shì)較為平穩(wěn)。綜合感官評(píng)分選擇裝液量60%為最佳發(fā)酵條件。

圖4 不同裝液量下糖的利用率

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察各因素對(duì)感官分?jǐn)?shù)的影響，借助Design Expert V 8.0.6軟件進(jìn)行分析。

以還原糖利用率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察酵母菌發(fā)酵階段的裝液量、料液質(zhì)量比、發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果表

通過(guò)分析軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸方程：Y=37.92-2.63A+5.01B-1.20C+2.39AB+1.33AC-1.82BC-7.07A2-8.39B2-2.59C2。其顯著性檢驗(yàn)與方差分析見表4。

表4 回歸方程顯著性檢驗(yàn)與方差分析

由表4可知，發(fā)酵階段模型p=0.003 2＜0.01，說(shuō)明建立的回歸方程模型極顯著；失擬項(xiàng)p=0.064 4＞0.05，不顯著，且R2=0.929 6，說(shuō)明試驗(yàn)的擬合情況好，而且試驗(yàn)的相對(duì)誤差小[25]；離散系數(shù)為10.80%，說(shuō)明試驗(yàn)的精確度很高；信噪比等于10.464，遠(yuǎn)大于4，說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)Ｐ湍艿玫胶軓?qiáng)的響應(yīng)信號(hào)[26]。模型可用于確定山藥桑黃發(fā)酵飲料的最佳工藝[27]。

2.2.2 因素交互作用響應(yīng)面分析

各因素對(duì)還原糖利用率影響的響應(yīng)面優(yōu)化圖見圖5。各因素在發(fā)酵過(guò)程的交互作用，料液質(zhì)量比（B）曲線相對(duì)較陡，因此料液質(zhì)量比對(duì)發(fā)酵過(guò)程中還原糖利用率的影響最顯著；裝液量（A）曲線較為平緩，響應(yīng)值變化隨其數(shù)值的變化較小，因此裝液量對(duì)發(fā)酵過(guò)程中還原糖利用率影響較小。

圖5 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面圖

2.2.3 優(yōu)化條件的確定和驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design Expert V 8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行分析確定獲得最佳工藝的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度26.5℃，裝液量60%，料液質(zhì)量比1∶7。在此條件下，產(chǎn)品的還原糖利用率的理論值可達(dá)37.92%。在此最佳工藝條件下，進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，還原糖利用率實(shí)際值為37.19%，與預(yù)測(cè)理論值相對(duì)誤差為1.93%。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明所得模型與實(shí)際情況擬合程度良好，能夠較好地反映出裝液量、發(fā)酵時(shí)間和料液質(zhì)量比與發(fā)酵過(guò)程中還原糖利用率之間的關(guān)系，可采用該模型對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以山藥和桑黃為原料，探究山藥桑黃酒精飲料在不同因素條件下的生產(chǎn)工藝，通過(guò)單因素和響應(yīng)面分析，得出山藥桑黃酒精飲料的最佳生產(chǎn)工藝為：山藥與桑黃漿質(zhì)量比19∶1，料液質(zhì)量比1∶7，酵母接種量體積分?jǐn)?shù)1%，發(fā)酵溫度26.5 ℃，發(fā)酵時(shí)間76 h，裝液量選擇60%。在此條件下，總糖和還原糖利用率最大，得到的產(chǎn)品為明黃色，色澤亮麗、澄清、嗅到有酒精醇香及特殊木質(zhì)香氣，品嘗有茶香，回味綿長(zhǎng)，并且含有較合適的酒精度（3.77%vol），和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（其中總黃酮0.023 g/L、三萜類物質(zhì)0.21 g/L）。產(chǎn)品含有山藥及桑黃的營(yíng)養(yǎng)成分，可以兼具山藥、桑黃和發(fā)酵飲料的多種營(yíng)養(yǎng)保健作用，為山藥和桑黃的開發(fā)利用提供新途徑。