虞記華，李月霞，陳 波，張 馳，胥方元△

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院,四川 瀘州 646000; 2.西南醫(yī)科大學,四川 瀘州 646000)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一類以病程長、病情反復為特點的臨床最常見的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病[1]，是老年人致殘主要原因之一[2]。目前，OA發(fā)病機制尚未完全清楚,現(xiàn)普遍認為在生物性和機械性因素共同作用下，關(guān)節(jié)軟骨合成及分解代謝失去平衡，導致關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡、細胞外基質(zhì)及軟骨下骨退變[3-4]。水通道蛋白(Aquaporins,AQP)是一種跨膜蛋白，對細胞能量平衡和水穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用[5]。其中AQP3主要功能是控制水和甘油、尿素等的小分子運輸[6]，可以增加細胞膜對水的通透性[7]。關(guān)節(jié)病變破壞可以上調(diào)軟骨AQP mRNA表達，促使軟骨細胞過度吸水腫脹后破裂、死亡[8]。電針作為一種重要的非藥物治療方法，可有效抑制軟骨細胞凋亡，延緩膝骨關(guān)節(jié)炎進展，臨床上被廣泛運用[9]。因此，通過檢測關(guān)節(jié)軟骨相關(guān)因子的表達水平，可以了解OA疾病發(fā)展情況及治療可能的作用機制。本研究電針刺激“血?！薄瓣幜耆薄盃俦恰薄白闳铩薄瓣柫耆薄傲呵稹钡瘸Ｓ醚ㄎ唬瑢?組實驗兔關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學變化、蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色及AQP3免疫組織化學(免疫組化)表達量進行統(tǒng)計分析，探索電針治療在OA中的可能作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5月齡健康新西蘭大耳兔36只，雌雄不限，體質(zhì)量(2.20±0.25)kg，由西南醫(yī)科大學動物實驗中心提供。實驗動物使用許可證號為SYXK(川)2013-065。本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學動物實驗倫理審查批準。

1.2 主要實驗試劑及儀器

兔抗人AQP3多克隆抗體試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司，BA1559);1寸漢醫(yī)針灸針(北京漢醫(yī)醫(yī)療器械公司);G6805-電針治療型低頻電針治療儀(蘇州醫(yī)藥用品有限公司);BMJ-B病理組織包埋機(中微電子儀器公司,中國常州);LEICA RM-2235切片機(德國LEICA公司);HFsafe 1200/C型生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司);TK-218IV型恒溫攤片烤片機 (中國泰維醫(yī)療科技有限責任公司);DK-8AD 型電熱恒溫水槽(上海恒科技術(shù)有限公司);S Spot M20-35S 型顯微成像儀(日本OLYMPUS公司);OLYMPUS CH-20型光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司);LEICA DM-4000B型熒光顯微分析系統(tǒng)(德國LEICA公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及處理方法 將36只兔分為對照組、模型組及電針組，每組12只。對照組不做干預(yù)，籠中正常飼養(yǎng)。采用石膏固定法，將模型組、電針組實驗兔的左膝關(guān)節(jié)伸直位固定6周建立模型。6周后解除石膏固定，模型組兔同電針組相同綁于治療臺20 min，不采取措施。電針組穴位參照《實驗針灸學》中“常用實驗動物針灸穴位”的相關(guān)規(guī)定定位選取左下肢血海、陰陵泉、犢鼻、足三里、陽陵泉和梁丘等穴位直刺0.3～0.5 cm進針；治療選用疏波，頻率2 Hz，電流為1～2 mA，20 min/d，治療14 d[10]。

1.3.2 組織切片制作 實驗結(jié)束后，對3組實驗兔進行以下處理：采用頸椎脫臼法處死所用實驗兔；取左股骨內(nèi)髁軟骨制成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小標本；甲醛固定；硝酸脫鈣；石蠟包埋，切片；切片HE染色；切片AQP3免疫組化。

1.4 檢測項目

1.4.1 觀察項目 參考Mankin評分標準[11]觀察軟骨病理切片大體形態(tài)及軟骨細胞HE染色情況及光學顯微鏡(光鏡)觀察免疫組化切片AQP3免疫反應(yīng)情況。

1.4.2 采用的方法 3組軟骨病理切片大體形態(tài)及軟骨細胞HE染色情況均參考Mankin評分標準從軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細胞情況、HE染色和潮線完整性等方面評估記錄結(jié)果。免疫組化切片AQP3免疫反應(yīng)情況通過觀察AQP3反應(yīng)部位，隨機選取每張切片的5個400倍的高倍鏡視野，觀察細胞質(zhì)顆粒棕黃著色的陽性細胞。統(tǒng)計每個視野里的陽性細胞數(shù)量和細胞總數(shù)量，以細胞分數(shù)=視野內(nèi)的陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%作為AQP3的表達量。每張切片采用2個不同的觀察者的計算值均數(shù)分別計算陽性細胞數(shù)量和細胞總數(shù)，從而誤差率控制在5%范圍以內(nèi)。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。定量資料采用均數(shù)±標準差表示，3組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 軟骨病理切片大體形態(tài)觀察

對照組：關(guān)節(jié)腔見少量透明清澈的關(guān)節(jié)液，未見明顯關(guān)節(jié)積液，可見藍白色光滑且明亮的關(guān)節(jié)軟骨，表面無裂紋、無贅生物。模型組：大部分關(guān)節(jié)腔內(nèi)明顯積液，黏稠、渾濁，軟骨偏暗黃甚至米黃色，光澤度較低，表面粗糙，有裂隙、裂紋、糜爛及潰瘍形成，關(guān)節(jié)負重面、軟骨下方骨質(zhì)外漏，骨贅形成，滑膜增生伴粘連。電針組：大部分軟骨變薄，稍淡黃色，表面不平整，散在點狀充血，偶見糜爛，關(guān)節(jié)內(nèi)少量關(guān)節(jié)積液伴滑膜增生。光澤度、滑膜水腫及關(guān)節(jié)積液情況電針組介于對照組與模型組之間，電針組與模型組比較(t=3.377，P=0.003)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表1。

表1 3組實驗兔的軟骨病理切片大體形態(tài)Mankin評分結(jié)果比較

2.2 光鏡下HE染色結(jié)果

對照組:關(guān)節(jié)軟骨表面平整光滑、結(jié)構(gòu)清晰、厚薄均勻，基質(zhì)著染均勻。軟骨細胞大小一致、排列整齊、潮線完整、無簇聚軟骨細胞。模型組:軟骨表層潰爛甚至缺失，厚度明顯變薄，出現(xiàn)較薄的鈣化層，基質(zhì)染色明顯減退，核濃縮，細胞數(shù)量大量減少，可見大量不規(guī)則形狀的大胞體軟骨細胞簇聚，潮線非常紊亂。電針組:關(guān)節(jié)軟骨表面較規(guī)則，略薄、較粗糙，偶見較小裂隙，軟骨細胞排列較整齊，數(shù)明顯增多，飽滿、核濃縮，細胞偶見破裂，厚度明顯增厚，染色輕度減退，潮線輕度紊亂。見圖1。

圖1 3組HE染色結(jié)果(100×，400×)

電針組關(guān)節(jié)軟骨細胞HE染色軟骨結(jié)構(gòu)(t=2.315，P=0.030)、軟骨細胞(t=2.236，P=0.035)、HE染色(t=0.56，P=0.048)、潮線完整性(t=2.7，P=0.028)Mankin評分結(jié)果與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 光鏡下AQP3表達的免疫組化測定

對照組為正常軟骨細胞，可見關(guān)節(jié)軟骨細胞質(zhì)中少量表達的棕黃色AQP3陽性細胞。模型組為退變軟骨細胞，可見關(guān)節(jié)軟骨細胞質(zhì)中大量表達的的棕黃色AQP3陽性細胞，表明AQP3表達明顯增強。電針組可見關(guān)節(jié)軟骨細胞質(zhì)中少量表達的棕黃色AQP3陽性細胞，細胞分數(shù)介于對照組和模型組之間見圖2。

注:a.對照組;b.模型組;c.電針組。圖2 3組AQP3染色結(jié)果(400×)

表2 3組兔關(guān)節(jié)軟骨細胞HE染色各項Mankin評分結(jié)果比較

對照組、模型組和電針組AQP3免疫組化切片陽性細胞百分數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=177.70，P<0.01)。電針組與模型組比較進行LSD檢驗(P<0.01)、對照組與模型組比較(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義。見表3。

表3 3組實驗兔的軟骨AQP3免疫組化切片陽性細胞百分數(shù)結(jié)果比較

3 討論

OA是一種退行性疾病，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，加重患者家庭的經(jīng)濟負擔[12]。且隨著人口老齡化問題日漸突出，OA發(fā)病率逐年升高，我國OA的發(fā)病率顯示女性高于男性，尤其以老年女性患者較為多見[13-14]。因此，探討其發(fā)病原因及發(fā)病機制，尋找有效預(yù)防及治療方法尤為重要[15]。

水通道蛋白(Aquaporins，AQP)是由4個亞基組成的跨膜蛋白。每個亞基均含有1個天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸重復串連序列的NPA特征性結(jié)構(gòu)域[16-17]。哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AQP 0～12的13種水通道蛋白[18],在維持細胞能量平衡和水穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。AQP3是AQP家族成員，主要功能是控制水和甘油、尿素等的小分子運輸，從而增加細胞膜對水的通透性[5-6]，其在AQP家族中與關(guān)節(jié)軟骨退行性變性關(guān)系最密切[19]。有研究顯示，關(guān)節(jié)病變破壞可以上調(diào)軟骨AQP mRNA表達，促使軟骨細胞過度吸水腫脹后破裂、死亡[7-8]。

正常關(guān)節(jié)軟骨由1%的軟骨細胞以及99%的軟骨細胞外的基質(zhì)共同組成。軟骨基質(zhì)除了為軟骨細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，還參與化學反應(yīng)的底物、傳遞信號，具有保護軟骨細胞的作用。軟骨基質(zhì)由膠原蛋白、蛋白多糖和水組成，正常情況下的軟骨基質(zhì)代謝能維持分解和合成動態(tài)平衡。因OA發(fā)病過程中軟骨基質(zhì)的分解速度大于合成速度，使得軟骨基本結(jié)構(gòu)遭到破壞，結(jié)合水丟失，軟骨細胞生存的生理環(huán)境惡化，AQP3 mRNA高表達，AQP3蛋白增多、活性增強，細胞過度吸水腫脹，最終發(fā)生破裂、死亡[20]。有研究表明，低頻脈沖超聲可以明顯抑制AQP3表達，作用機制可能通過改變細胞外基質(zhì)成分、下調(diào) AQP3 mRNA表達及磷酸化改變AQP3蛋白結(jié)構(gòu)，降低了水跨膜轉(zhuǎn)運，從而減少關(guān)節(jié)腔積液、減輕周圍組織水腫，進而改善OA癥狀[21]。

通過分析本實驗數(shù)據(jù)模型組關(guān)節(jié)軟骨的病理切片發(fā)現(xiàn)大體形態(tài)積液明顯，關(guān)節(jié)腔，軟骨偏暗黃，光澤度較低、表面粗糙，有裂隙、裂紋、糜爛及潰瘍形成，骨贅形成，滑膜增生伴粘連，軟骨細胞數(shù)明顯增多，軟骨層明顯增厚，潮線輕度紊亂?；さ冉M織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時，會伴有充血、水腫以及炎癥介質(zhì)大量聚集等情況，同時會分泌出多種類型蛋白酶，進而造成軟骨代謝發(fā)生異常[22-23]。同時軟骨基質(zhì)逐漸分解加劇，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)會受到不可逆性損傷，從而表現(xiàn)為相應(yīng)臨床癥狀，使得 KOA 疾病進展加速[24-25]。電針組關(guān)節(jié)情況較好，僅出現(xiàn)少量關(guān)節(jié)內(nèi)積液與輕度滑膜增生，軟骨表面較規(guī)則且裂隙少，細胞排列較整齊且AQP3表達減少。因此，可推斷電針通過下調(diào)AQP3 mRNA表達，降低AQP3含量來調(diào)控水的轉(zhuǎn)運，降低了細胞基質(zhì)的降解，降低了水跨膜轉(zhuǎn)運，減少軟骨細胞過度吸水腫脹而發(fā)生破裂、死亡，降低關(guān)節(jié)軟骨的破壞，從而保護軟骨作用，改善OA癥狀。

目前治療國內(nèi)外尚無特效方法OA，主要以緩解疼痛、改善癥狀和延緩疾病進展為目的，治療手段主要有手術(shù)和非手術(shù)兩種。非手術(shù)療法包括西醫(yī)、中醫(yī)和中西結(jié)合等。而非手術(shù)治療中，電針為中西結(jié)合治療方法，因其療效確切，治療安全方便、副作用少等特點，因而具有較強的基礎(chǔ)、臨床研究價值。同時，本研究也具有一定的局限性：①電針在治療頻率、劑量、時間和波型等尚未有統(tǒng)一標準，參數(shù)主要來源于OA動物實驗研究數(shù)據(jù);②實驗中“得氣”無法定量，較難精準掌握;③有研究發(fā)現(xiàn)，OA發(fā)病早期軟骨中AQP3蛋白表達主要在軟骨上中部及增生區(qū)，晚期則在軟骨中下部，與正常軟骨存在差異，本實驗的實驗時間較短，僅采用關(guān)節(jié)晚期的實驗數(shù)據(jù)，無法對整個OA發(fā)展過程進行研究。因此，由于OA發(fā)病過程中，AQP3蛋白表達存在早中晚期差異，需在后續(xù)加大樣本量的同時，進一步開展電針在OA不同時期AQP3蛋白表達的研究。同時，OA的發(fā)展受到多重因素影響，AQP3作為其中一個調(diào)節(jié)機制，與其他的調(diào)節(jié)機制共同作用關(guān)系，其上游調(diào)控途徑尚未明確，尚需進一步研究。

綜上所述，電針能夠下調(diào)關(guān)節(jié)炎軟骨中AQP3蛋白表達，有效緩解膝OA的癥狀，是一種值得推廣的治療手段。