依達拉奉對氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變?nèi)槭蟮淖饔眉捌錂C制研究*

姚東偉，田川，胡東瑞，曹瑾，楊路，張萍

（1.寧波市第一醫(yī)院 眼科，浙江 寧波315012；2.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 眼科，浙江 寧波 315000）

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變是一種復(fù)雜的多因素疾病，主要病理特征為早期視網(wǎng)膜血管閉塞導(dǎo)致大量異常新生血管形成，容易發(fā)生出血、滲出等，嚴重者可引起視網(wǎng)膜脫離，視力喪失[1]。隨著醫(yī)療水平的提高，越來越多的早產(chǎn)兒得到成功救治，新生兒存活率顯著提高，但早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變發(fā)病人數(shù)卻隨之增加。早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變發(fā)病機制復(fù)雜，其中給氧治療與早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，吸氧過程中存在氧自由基損傷，其在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[2]。高氧可誘導(dǎo)未發(fā)育成熟的視網(wǎng)膜血管收縮，甚至閉塞，視網(wǎng)膜組織氧含量相對降低，引起一些血管生長因子分泌，促進新生血管形成，從而誘導(dǎo)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變[3]。依達拉奉為神經(jīng)保護藥物，同時也是一種強效的抗氧化劑，具有較強的氧自由基清除能力，可以保護組織免受氧化應(yīng)激損傷[4-5]，如依達拉奉可通過清除氧自由基減輕阿爾茨海默病患者的神經(jīng)損傷[6]，提高急性腦梗死的治療效果[7]。依達拉奉對糖尿病視網(wǎng)膜病變中具有保護作用，可通過提高抗氧化成分活性，加速自由基清除，減輕視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮對視網(wǎng)膜的保護作用[8]，但其在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變中的作用尚不清楚。本文通過復(fù)制早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變動物模型，研究依達拉奉對氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變?nèi)槭蟮淖饔眉翱赡軝C制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級、7日齡C57BL/6 乳鼠購自上海斯萊克有限公司，動物許可證號：SCXK（蘇）2018-0003。將60 只乳鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為正常對照組、高氧誘導(dǎo)組和藥物治療組，每組20 只。

1.2 主要試劑和儀器

依達拉奉（淮南市國藥集團國瑞藥業(yè)，批號1709134），伊紅、蘇木精（美國Sigma 公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活力檢測試劑盒和丙二醛（malondialdehyde, MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）酶（上海生工生物工程股份有限公司），兔抗鼠血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）單克隆抗體和兔抗鼠CD34 單克隆抗體（美國Abcam 公司），DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），BX43 型顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.3 動物模型的復(fù)制

高氧誘導(dǎo)組和藥物治療組乳鼠在高氧倉（自制）中生活5 d（出生第7 ～11 天），期間由原母鼠和1 只替換母鼠間隔12 h 交替哺乳。高氧倉氧流量控制在1.5 L/min，使倉內(nèi)氧濃度在75%左右，溫度控制在21℃左右，氧分壓為常壓，采用測氧儀測定倉內(nèi)氧濃度4 ～6 次/d；每天定時進行加食、換水、更換墊料。正常對照組乳鼠在正?？諝庵酗曫B(yǎng)。5 d 后（出生第12 天起），將高氧誘導(dǎo)組和藥物治療組乳鼠從高氧倉中取出，放到正?？諝庵酗曫B(yǎng)。藥物治療組給予依達拉奉3 mg/kg，用生理鹽水稀釋后靜脈注射；高氧誘導(dǎo)組和正常對照組乳鼠給予等量生理鹽水靜脈注射。用藥至出生第16 天，每天測量乳鼠體重，出生第17 天進行取材檢測。

1.4 取材

各組選10 只乳鼠，取出其右眼球，4%甲醛固定，用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色；取左眼球，剝離視網(wǎng)膜，用于生化檢測。各組取5 只乳鼠，取眼球，4%甲醛固定，用于ADP 酶染色；取各組剩余5 只乳鼠視網(wǎng)膜用于檢測VEGF 表達。

1.5 視網(wǎng)膜SOD 活力和MDA 含量檢測

將乳鼠視網(wǎng)膜組織勻漿，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用黃嘌呤法測定視網(wǎng)膜SOD 活力和MDA 含量。

1.6 視網(wǎng)膜HE 染色

將各組乳鼠視網(wǎng)膜組織用甲醛固定3 ～5 d，梯度酒精脫水，二甲苯透明，經(jīng)浸蠟、石蠟包埋，切成4μm 厚切片，烤片6 ～12 h。梯度酒精脫蠟復(fù)水，切片蘇木精染色5 min，自來水返藍，再伊紅染色3 ～5 min，自來水沖洗，經(jīng)脫水、透明、封固。顯微鏡下觀察，細胞漿呈粉紅色，細胞核呈藍色。

1.7 視網(wǎng)膜ADP 染色

將各組乳鼠視網(wǎng)膜用0.05 mol/L Tris-順丁烯二酸緩沖液沖洗。配置反應(yīng)液：0.2 mol/L Tris-順丁烯二酸緩沖液+硝酸鉛3.0 mmol/L+氯化鎂6.0 mmol/L+ADP 粉末1 g/L。將視網(wǎng)膜置入配置的反應(yīng)液中孵育15 min，Tris-順丁烯二酸緩沖液沖洗，加入1 ∶10 稀釋的硫化銨染色5 min，可見棕色沉淀，Tris-順丁烯二酸緩沖液沖洗，50%甘油-PBS 封片，顯微鏡下觀察并拍照。采用Image-ProPlus 測量高氧誘導(dǎo)組和藥物治療組乳鼠視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積。

1.8 免疫組織化學(xué)染色檢測視網(wǎng)膜中VEGF、CD34 的表達

將視網(wǎng)膜石蠟包塊經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，過氧化氫孵育15 min，阻斷、滅活內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液水煮10 min 修復(fù)抗原，加入一抗（兔抗鼠VEGF 單克隆抗體、兔抗鼠CD34 單克隆抗體），過夜孵育，加入二抗孵育30 min，DAB 染色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，經(jīng)干燥、封片、拍照觀察。采用Image-ProPlus 測定各組視網(wǎng)膜組織中VEGF、CD34 的累積光密度值和平均光密度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組乳鼠體重變化

3 組乳鼠出生后12 d、13 d、14 d、15 d 和16 d的體重比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的乳鼠體重有差別（F=19.055，P=0.000）；②3組乳鼠體重有差別（F=31.229，P=0.000）；③各組乳鼠體重變化趨勢有差別（F=3.688，P=0.000）。見表1。

表1 各組乳鼠不同時間點的體重比較 （n =20，g，±s）

表1 各組乳鼠不同時間點的體重比較 （n =20，g，±s）

組別 12 d 13 d 14 d 15 d 16 d正常對照組 5.08±1.19 5.42±1.29 5.70±1.30 5.82±1.43 5.79±1.42高氧誘導(dǎo)組 4.39±0.37 4.50±0.38 4.53±0.39 4.52±0.41 4.63±0.38藥物治療組 4.26±0.48 4.64±0.53 4.85±0.52 5.19±0.57 5.44±0.59

2.2 各組乳鼠視網(wǎng)膜SOD 活力和MDA 含量比較

各組乳鼠視網(wǎng)膜SOD 活力和MDA 含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，高氧誘導(dǎo)組SOD 活力降低（P＜0.05），MDA 含量升高（P＜0.05）；與高氧誘導(dǎo)組比較，藥物治療組SOD活力升高（P＜0.05），MDA 含量降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組乳鼠視網(wǎng)膜SOD 活力和MDA 含量比較（n =10，±s）

表2 各組乳鼠視網(wǎng)膜SOD 活力和MDA 含量比較（n =10，±s）

注：①與正常對照組比較，P ＜0.05；②與高氧誘導(dǎo)組比較，P ＜0.05

組別 SOD/（u/mg） MDA/（nmol/mg）正常對照組 22.564±3.323 9.882±1.361高氧誘導(dǎo)組 18.358±1.367① 15.507±1.785①藥物治療組 21.280±2.120② 10.383±1.086②F 值 8.005 46.761 P 值 0.002 0.000

2.3 各組乳鼠視網(wǎng)膜HE 染色結(jié)果

正常對照組乳鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰、層次分明，未見病變；高氧誘導(dǎo)組乳鼠視網(wǎng)膜節(jié)細胞層疏松水腫，節(jié)細胞層和內(nèi)網(wǎng)層內(nèi)及內(nèi)界膜外層見大量血管增生并伴管腔擴張，節(jié)細胞層和內(nèi)網(wǎng)層見出血；藥物治療組節(jié)細胞層和內(nèi)網(wǎng)層未見出血，余病變同高氧誘導(dǎo)組。見圖1。

2.4 各組乳鼠視網(wǎng)膜ADP 染色結(jié)果

正常對照組乳鼠視網(wǎng)膜無明顯深棕色沉淀，高氧誘導(dǎo)組乳鼠視網(wǎng)膜深棕色沉淀明顯，藥物治療組視網(wǎng)膜深棕色沉淀較高氧誘導(dǎo)組減輕（見圖2）。藥物治療組、高氧誘導(dǎo)組視網(wǎng)膜ADP 染色無灌注區(qū)面積分別為（2.62±0.55）×106μm2和（3.94±1.11）×106μm2，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.377，P=0.045），藥物治療組小于高氧誘導(dǎo)組。

圖1 各組乳鼠視網(wǎng)膜 （HE 染色×400）

圖2 各組乳鼠視網(wǎng)膜 （ADP 染色）

2.5 各組乳鼠視網(wǎng)膜VEGF 的表達

各組乳鼠視網(wǎng)膜VEGF 累積光密度值和平均光密度值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，高氧誘導(dǎo)組視網(wǎng)膜VEGF 累積光密度值和平均光密度值升高（P＜0.05）；與高氧誘導(dǎo)組比較，藥物治療組視網(wǎng)膜VEGF 累積光密度值和平均光密度值降低（P＜0.05）。見表3 和圖3。

表3 各組乳鼠視網(wǎng)膜VEGF 光密度值比較 （n =5，±s）

表3 各組乳鼠視網(wǎng)膜VEGF 光密度值比較 （n =5，±s）

注：①與正常對照組比較，P ＜0.05；②與高氧誘導(dǎo)組比較，P ＜0.05。

組別 累積光密度值 平均光密度值正常對照組 11 566.4±3 609.0 0.17535±0.02903高氧誘導(dǎo)組 20 652.8±4 086.5① 0.24536±0.03000①藥物治療組 14 233.2±1 557.4② 0.18555±0.02402②F 值 10.178 9.249 P 值 0.003 0.004

圖3 各組乳鼠視網(wǎng)膜VEGF 的表達 （免疫組織化學(xué)染色×200）

2.6 各組乳鼠視網(wǎng)膜CD34 的表達

各組乳鼠視網(wǎng)膜CD34 累積光密度值和平均光密度值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，高氧誘導(dǎo)組視網(wǎng)膜CD34 累積光密度值和平均光密度值升高（P＜0.05）；與高氧誘導(dǎo)組比較，藥物治療組視網(wǎng)膜CD34 累積光密度值和平均光密度值降低（P＜0.05）。見表4和圖4。

表4 各組乳鼠視網(wǎng)膜CD34 光密度值比較 （n =5，±s）

表4 各組乳鼠視網(wǎng)膜CD34 光密度值比較 （n =5，±s）

注：①與正常對照組比較，P ＜0.05；②與高氧誘導(dǎo)組比較，P ＜0.05。

組別 累積光密度值 平均光密度值正常對照組 175 745±63 992 0.6501±0.03623高氧誘導(dǎo)組 319 119±105 148① 0.6999±0.01349①藥物治療組 80 470±69 778② 0.6024±0.05599②F 值 9.582 7.711 P 值 0.004 0.007

圖4 各組乳鼠視網(wǎng)膜CD34 的表達 （免疫組織化學(xué)染色×400）

3 討論

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變是低出生體重兒和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜毛細血管發(fā)育異常導(dǎo)致的一種視網(wǎng)膜病變，嚴重者可致盲。早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜新生血管增生、神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致視網(wǎng)膜及視功能損害。新生血管形成涉及多種細胞因子，包括促血管生成因子和抑制血管生成因子，其中VEGF 在正常視網(wǎng)膜血管生成和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變發(fā)病中發(fā)揮重要作用[9]。

給氧是發(fā)生早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的主要因素，給氧可導(dǎo)致氧自由基增多，過多的氧自由基可引起視網(wǎng)膜損傷[10]。SOD 在生物體各種組織中廣泛存在，為氧自由基清除劑，是重要的抗氧化酶[11]。MDA 為自由基作用于脂質(zhì)、發(fā)生過氧化反應(yīng)的中間產(chǎn)物，可引起蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子發(fā)生聚合，具有細胞毒性[12]。SOD 活力降低、MDA 含量升高表明氧化應(yīng)激程度增加。VEGF 為主要促血管形成因子，在新生血管形成中發(fā)揮促進作用，其水平升高可反映新生血管形成增加[13-14]。ADP 染色深棕色沉淀增加也反映新生血管形成增加[15]。CD34 抗原主要在造血干細胞和血管內(nèi)皮細胞中表達，是一種跨膜細胞糖蛋白，可用于標記新生血管。在視網(wǎng)膜新生血管中，CD34 陽性表達。視網(wǎng)膜中CD34 陽性表達增加，表明血管新生增加[16]。結(jié)合本研究結(jié)果分析高氧可誘導(dǎo)乳鼠視網(wǎng)膜病變，高氧可導(dǎo)致視網(wǎng)膜氧自由基增加，過多的氧自由基引起視網(wǎng)膜VEGF 和CD34 表達水平升高，VEGF 和CD34的高表達表明高氧誘導(dǎo)可促進新生血管形成，從而誘發(fā)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變。

目前早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的主要治療手段包括冷凝、激光光凝、抗VEGF 等，冷凝和激光治療雖然有一定療效，但是對視網(wǎng)膜的破壞程度較大，部分患者仍有遺留視覺功能障礙和最終失明的風(fēng)險[17]?？筕EGF 通過抑制異常新生血管增生治療早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，但可帶來眼內(nèi)外不良反應(yīng)。目前早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的治療手段主要針對血管增殖期，通過抑制或破壞新生血管達到治療目的[18]，但這一時期視網(wǎng)膜損傷已形成，故療效不理想。

本文對氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變?nèi)槭竽Ｐ褪褂靡肋_拉奉治療，發(fā)現(xiàn)與高氧誘導(dǎo)組比較，藥物治療組體重升高，視網(wǎng)膜SOD 活力升高，MDA 含量降低，視網(wǎng)膜VEGF、CD34 累積光密度值和平均光密度值降低；HE 染色顯示視網(wǎng)膜病變減輕；視網(wǎng)膜ADP 染色無灌注區(qū)面積減小。依達拉奉為神經(jīng)保護藥物，對視網(wǎng)膜組織神經(jīng)細胞具有保護作用[19-20]。依達拉奉也是一種強效抗氧化劑，清除自由基的能力很強，可通過清除氧自由基保護組織免受氧化應(yīng)激損傷[21-22]。依達拉奉對視網(wǎng)膜病變也有保護作用，如AKIYAMA 等[23]發(fā)現(xiàn)依達拉奉可預(yù)防視神經(jīng)損傷后小鼠視網(wǎng)膜變性；XU等[24]發(fā)現(xiàn)依達拉奉可通過PI3K/Akt/Nrf2 途徑保護視網(wǎng)膜免受缺血再灌注引起的氧化損傷；HIRONAKA等[25]發(fā)現(xiàn)載有依達拉奉的脂質(zhì)體可保護視網(wǎng)膜免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷。由此可見，依達拉奉具有抑制氧化損傷保護視網(wǎng)膜的作用。本研究結(jié)果表明，依達拉奉可減輕氧自由基對視網(wǎng)膜的損傷，抑制VEGF、CD34 的表達，從而抑制氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變?nèi)槭笠暰W(wǎng)膜新生血管形成。初步分析依達拉奉可能通過抗氧化作用減輕氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變?nèi)槭笱踝杂苫鶕p傷，降低因氧自由基損傷導(dǎo)致的VEGF 表達水平升高，從而抑制視網(wǎng)膜新生血管形成，發(fā)揮對視網(wǎng)膜的保護作用。

綜上所述，依達拉奉對氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變具有保護作用，其機制可能與抑制視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制視網(wǎng)膜新生血管形成有關(guān)。