PGPR菌劑對砷脅迫下蜈蚣草根際微生物群落的影響

官宇　余偉　辜運富　張宗錦　馮文龍　楊軍偉

摘要：為揭示PGPR菌劑（植物根際促生菌）對蜈蚣草修復砷污染土壤的影響機理，為植物—微生物聯(lián)合修復砷污染土壤提供技術支撐，采用盆栽試驗將PGPR菌劑加入受砷脅迫的蜈蚣草中進行培養(yǎng)，利用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，簡稱DGGE）技術對接種PGPR菌劑的盆栽蜈蚣草根際細菌多樣性進行研究，并分析根際細菌在重金屬與PGPR菌劑脅迫下的群落結構特征。測定根際土壤中的砷含量、pH值、有機質含量、有效磷含量、速效鉀含量，根據(jù)植株外在發(fā)育情況與內(nèi)在的營養(yǎng)物質及對砷修復量進行比較，得出芽孢桿菌（Bacillus）添加細桿菌屬（Microbacterium）細菌對蜈蚣草生長發(fā)育起到重要影響。典范對應分析（canonical correspondence analysis，簡稱CCA）結果顯示，pH值、速效氮含量、有效磷含量是影響土壤種群結構、促進蜈蚣草吸附砷的重要因素。

關鍵詞：PGPR菌劑;蜈蚣草;多樣性;砷修復

中圖分類號： X172;S182? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0275-05

收稿日期：2020-02-26

基金項目：四川省煙草研發(fā)項目計劃（編號：20180027）。

作者簡介：官 宇（1983—），男，重慶北碚人，碩士，農(nóng)藝師，研究方向為煙草栽培。E-mail：18871453@qq.com。

通信作者：余 偉，碩士，農(nóng)藝師，研究方向為煙草栽培。E-mail：1029443321@qq.com。

隨著經(jīng)濟全球化的快速發(fā)展，經(jīng)濟遺留垃圾所帶來的環(huán)境問題逐漸突顯，如木材防腐劑帶來的As-Zn 復合污染[1]，農(nóng)藥的過度使用造成As-Pb在土壤中的富集[2]。這些殘留重金屬的累積不僅會對土壤本身造成污染，影響土壤中的生態(tài)環(huán)境，還會通過食物鏈進入到人體，威脅人類健康[3]。因此，土壤重金屬修復技術逐漸受到廣泛的關注，一般包括以下幾種：固定、穩(wěn)定化技術和土壤淋洗技術、原位電動修復技術、生物修復技術等[4-5]。相比植物修復而言，這些技術都存在著成本比較高，對環(huán)境影響程度大等缺點[6]。

近年來，關于植物修復重金屬污染土壤的研究越來越多，其中超富集植物的研究是發(fā)展植物修復技術的基礎。超富集植物是一種可以在體內(nèi)超量累積重金屬并能將其從土壤中分離的特殊植物[7]。其中，蜈蚣草是首次報道發(fā)現(xiàn)的一種砷的超富集植物[8]，它具有耐砷特性，對砷的富集能力極強，最大含砷量是一般植株的數(shù)萬倍甚至數(shù)十萬倍[9]，因此將蜈蚣草用于砷污染土壤的修復具有很大的研究意義。植物-微生物協(xié)同修復技術是目前最有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N生物修復技術，可充分發(fā)揮植物與微生物的各自優(yōu)勢，取長補短，提高污染土壤修復效率，杜絕二次污染，利用植物根際促生細菌（PGPR）菌劑與植物協(xié)同進行砷污染土壤修復是當前砷污染土壤生物修復的研究熱點。

本試驗對前期從蜈蚣草中提取出的植物根際促生細菌（PGPR）進行培養(yǎng)后制成菌劑，并將其接種于蜈蚣草盆栽之中，探究盆栽試驗條件下，接種PGPR菌劑對砷污染土壤中蜈蚣草根際細菌群落結構和多樣性的影響，并結合盆栽試驗中植株生長狀況、土壤理化性質、土壤砷含量的測定結果，分析PGPR菌劑對蜈蚣草生長、土壤中砷富集特性的影響，以期篩選出最佳菌劑組合，為植物-微生物聯(lián)合修復砷污染土壤提供理論基礎和技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 盆栽試驗

本試驗于2016—2019年在四川農(nóng)業(yè)大學溫江校區(qū)進行。從網(wǎng)上選購33株長勢幾乎完全相同的蜈蚣草進行1株1盆的盆栽培養(yǎng)，除其中3盆不加菌劑作為空白對照（CK）之外，其他所有植株均按每3盆為1組加入不同組合的PGPR菌劑，PGPR菌劑直接接種在根圍土壤中，并向每株植株土壤（包括空白對照）中加入亞砷酸鈉，使砷的含量為150 mg/kg。將所有植株放入光照室內(nèi)進行人工培養(yǎng)6個月。其中，編號T1～T10為試驗組，空白對照組為T11。以芽孢桿菌（Bacillus）、農(nóng)桿菌（Agrobacterium）、假單胞菌（Pseudomonas）這3類種屬細菌設置菌劑組合，具體處理見表1。

1.2 蜈蚣草稱質量

培養(yǎng)6個月后挖取盆栽蜈蚣草，每株植株以其根基處為中心，提取10 cm×10 cm正方形土壤內(nèi)根系，洗凈后分開保存。將根系與植株地上部在110 ℃ 下殺青0.5 h，隨后調整溫度至75 ℃恒溫烘干，稱質量，以干質量（表2）作為蜈蚣草生物量[10]。

1.3 蜈蚣草根際土總DNA的提取

采集每個重復樣品中長勢最好的蜈蚣草根際土壤，稱取質量相當于0.5 g風干土的新鮮土樣（約0.612 g），采用土壤DNA提取試劑盒[FastDNA spin kit for soil （Qbiogene公司生產(chǎn)）]中給定的操作步驟進行土壤總DNA的提取。

1.4 16S rRNA基因擴增

利用巢氏聚合酶鏈式反應（PCR）對提取出的DNA進行擴增，第1輪以27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGA-3′）為引物。PCR體系為50 μL：混合液25 μL，引物各4 μL，DNA 4 μL，雙蒸水（ddH2O）13 μL。PCR程序：94 ℃ 預變性5 min;94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)33次;72 ℃ 10 min[11]。第2輪以338F（GC）[5′-（CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG）CCTACGGGAGGCAGCAG-3′]和518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）為引物。PCR 體系：Mix 25 μL，引物各4 μL，DNA 4 μL，加ddH2O至總體積50 μL。PCR 程序：94 ℃5 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)30次;72 ℃ 10 min[12]。

1.5 變性梯度凝膠電泳

取第2輪PCR產(chǎn)物15 μL進行變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析，設置變性劑濃度梯度為30%～60%，聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，在1×TAE緩沖液中于電壓為120 V、溫度為60 ℃下恒溫電泳7 h。電泳完成后，用硝酸銀進行染色[13]。DGGE圖譜用數(shù)碼相機進行拍照。

1.6 克隆與測序

切取“1.5”節(jié)中DGGE條帶（PCR產(chǎn)物）用Clean-Up試劑盒進行純化后，與pGEM-T Easy Vector載體進行連接，利用大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α感受態(tài)細胞進行轉化，轉化后的細胞用氨芐青霉素抗性基因和PCR進行檢測。通過藍白斑篩選陽性克隆子并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Excle對原始數(shù)據(jù)進行基本處理和分析，SPSS 17.0進行Duncans 單因素方差分析;通過Bio-Rad公司的Quantity One 4.4進行DGGE圖譜分析;基于Neighbor-joining法，用MEGA 5.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹;利用Shannon多樣性指數(shù)（H）、豐富度（S）和均勻度（Eh）來評價群落結構多樣性;采用CANOCO 4.5軟件中的典型相關分析（canonical correlation analysis，簡稱CCA）程序對土壤細菌群落與土壤理化性質間的內(nèi)在關系進行分析（P<0.05）。多樣性指數(shù)計算公式為

H=-∑niNlnniN。（1）

Eh=HlnS。（2）

式中：ni為單一條帶的強度;N為所有條帶的總強度;S為每個泳道總的條帶數(shù)。

2 結果與分析

2.1 不同PGPR菌劑組合處理下的土壤理化性質分析

從表3可以看出，土壤樣品為酸性土壤，對比空白對照，各菌劑組合會降低土壤中pH值;蜈蚣草對酸性土壤有較強的耐受性，且在酸性環(huán)境下對重金屬依舊有很強的吸附性[14]，所以pH值的改變不影響其吸砷效果。通過對比各處理數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，T1試驗組土壤中有機質、有效磷、速效鉀、速效氮含量最高。另外，這3組處理的共同點是菌劑組合中均包括芽孢桿菌（Bacillus），可以推測芽孢桿菌（Bacillus）的添加對植株的生長環(huán)境有優(yōu)化作用。

2.2 不同PGPR菌劑組合處理下的土壤群落結構分析

DGGE圖譜中處在不同位置上的條帶代表的細菌不同，條帶數(shù)量越多，說明該樣品生物多樣性越豐富;菌落種屬越多，其條帶強度越強[15]。從圖1可以看出，每個泳道中的條帶在數(shù)量、強弱和位置上均存在差異性，且每個泳道有各自的優(yōu)勢條帶，表明PGPR菌劑的添加，改變了土壤中細菌的種群結構。

將這11個樣品進行DGGE后，對電泳圖譜中各樣品的共有以及特異性條帶進行切膠回收及克隆測序，共得到13條有效序列（A1～A13）。把測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)序列進行Blast比對，找出同源性最高的序列，進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，結果如圖2所示。

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，13條回收序列所對應的分屬于鏈霉菌屬 （Streptomyces ）、草酸桿菌屬（Oxalobacteraceae）、Thermosporotrichaceae、黃單胞菌屬（Xanthomonadaceae）、硝化桿菌（Nitrobacter）、伯克氏菌屬（Burkholderiales）、疣微菌屬（Verrucomicrobium）、不可培養(yǎng)細菌（Uncultured bacterium）、γ-變形菌（Gammar proteobacterium）、乳桿菌屬（Acidobacterium）、綠色彎菌（Chloroflexi）、微桿菌屬（Microbacterium）、假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）。說明不同處理下的蜈蚣草根際土壤細菌具有一定的多樣性和豐度。

根據(jù)圖2通過Quantity one進行多樣性指數(shù)計算。由表4可以看出， 不同處理的蜈蚣草樣品根際土壤中微生物的豐富度、多樣性、均勻度有所不同。其中，T1、T9、T10處理的多樣性指數(shù)明顯優(yōu)勢于其他處理，表明添加不同PGPR菌劑對蜈蚣草根際土壤的微生物群落結構產(chǎn)生的影響存在差異。

2.3 土壤理化性質與根際土壤中細菌多樣性指數(shù)的相關性分析

由表5可以看出，土壤微生物群落多樣性指數(shù)均與總砷含量呈極顯著負相關;多樣性指數(shù)、均勻度與有效磷含量呈顯著正相關，說明蜈蚣草根際微生物群落結構受土壤總砷含量和有效磷含量明顯影響。

2.4 土壤理化性質與土壤樣品優(yōu)勢細菌種群結構的CCA分析

圖3顯示，第1排序軸解釋了細菌群落變化的12.2%，第2排序軸解釋了細菌群落變化的7.9%。圖3中箭頭連線的長度表示相應理化性質與群落結構的相關程度的大小，連線越長表示其對群落結構的影響越大?？芍琾H值與2個排序軸呈負相關，而速效氮含量、速效鉀含量與第1排序軸相關程度較高，且箭頭線較長，說明與第1排序軸相關的土壤理化性質為速效鉀含量和速效氮含量（P<0.05）。而在第2排序軸上有效磷含量箭頭線較長，說明其對土壤細菌群落結構具有較大影響（P<0.05）?？傮w來看，本研究中土壤速效氮、速效鉀、有效磷含量是影響蜈蚣草根際微生物群落結構的關鍵土壤理化因子。

3 討論

3.1 不同處理下的PGPR菌劑對蜈蚣草長勢和土壤理化性質的影響

劉鵬等研究指出，PGPR菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應用效果較好[16]。本試驗通過變換PGPR菌劑組合的方式，對砷脅迫下的蜈蚣草進行澆灌培養(yǎng)，篩選出品質、效果最好的PGPR菌劑組合，以提高蜈蚣草對于土壤中砷吸附的效應。通過綜合對比發(fā)現(xiàn)，雖然有一部分組合菌劑對蜈蚣草并未起到促砷吸附作用，但仍然篩選出了3組與空白對照相比，對蜈蚣草長勢、吸砷效果促進作用更強的菌劑，即T1、T9、T10。研究顯示，不同微生物對蜈蚣草的促砷吸附效果有所不同[17]。

土壤微生物數(shù)量、種類變化對土壤中的有機質礦化速度及各種養(yǎng)分的狀態(tài)有所影響，所以，好的微生物群落結構可以促進土壤理化指標的轉化，從而提高土壤養(yǎng)分含量[18]。通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，與空白對照相比，對蜈蚣草有促進砷吸收作用的PGPR菌劑組合處理的土壤各項理化性質皆得到了改善。

3.2 不同PGPR菌劑組合對蜈蚣草根際中菌落結構的影響

通過分析DGGE圖譜可以看到，與空白對照相比，添加不同PGPR菌劑組合的植株根際土壤細菌多樣性、群落結構均存在差異性，由此表明，PGPR菌劑的添加，對土壤的種群結構產(chǎn)生了影響。向土壤添加或接種外源微生物會對土壤中原微生物群落結構造成直接或間接的影響，從而影響土壤所發(fā)揮的生態(tài)效應[19]。

3.3 土壤環(huán)境因子對蜈蚣草根際土壤群落的影響

土壤的環(huán)境因子會改變土壤中的微生物種群結構，典范對應分析將環(huán)境因子作為約束條件進行排序分析，從而分析出環(huán)境因子對微生物群落所產(chǎn)生的影響。有研究指出，根際土壤中的細菌群落數(shù)量與pH值、速效磷含量、速效氮含量呈顯著相關[20]。在本研究中土壤速效氮和速效磷和速效鉀是影響砷脅迫下蜈蚣草根際土壤微生物群落變異的重要因子。而在筆者所在研究團隊前期研究中也發(fā)現(xiàn)，土壤鉀含量及有效性也是影響細菌群落多樣性和豐富度的重要因素[21]?？梢?，土壤氮磷鉀等養(yǎng)分是影響土壤微生物群落結構的重要因素，也影響著土壤砷的有效性進而調控蜈蚣草對砷污染土壤的修復效果[22]。

4 結論

PGPR菌劑會對砷脅迫下的蜈蚣草生物量、砷富集量以及根際微生物群落結構產(chǎn)生明顯影響，其中以添加芽孢桿菌（Bacillus）細菌的處理對蜈蚣草生長發(fā)育影響最明顯。砷脅迫下，蜈蚣草根際微生物群落結構受土壤速效氮、速效鉀、有效磷含量的影響。

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